马铃薯不耐连作，但是栽培马铃薯高收益与集约化导致甘肃等马铃薯主产区连作现象日趋严重，已经成为影响马铃薯种植和产业进一步发展的主要限制因素^［1-3］。枯萎病的发生和自毒物质是作物连作障碍产生的主要原因^［4］。我们在甘肃省马铃薯主产区定西市的前期研究发现，连作使马铃薯抗病性减弱，土传枯萎病加剧，发病率高达80%以上，减产严重^［5］。尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）是马铃薯发生枯萎病的主要病原菌^［1，6］。尖孢镰孢菌可以在土壤中存活5—6年，一般致病率10%—30%，严重的达80%，成为当前最难防治的土传病害^［7-8］。植物根系分泌物中的有机酸在土壤中积累过多，直接或间接地影响植物病原菌生长，诱导病原菌孢子萌发^［9］。番茄根系分泌物能促进尖孢镰孢菌致病菌株Fol007的分生孢子萌发^［10］。西瓜感病品种的根系分泌物在低浓度下就能有效促进尖孢镰孢菌的生长^［11］。寄主根部很近或接触的病原菌吸收到根表细胞分泌的碳等营养物质（主要是小分子有机酸）后就能萌发出芽管或菌丝进而侵染形成土传病害^［12-13］。我们对甘肃定西旱地连作马铃薯根系分泌物中的有机酸进行系统的分离鉴定，研究旱地连作马铃薯根系分泌物中差异有机酸对马铃薯尖孢镰孢菌的化感效应，以期为揭示马铃薯连作引起枯萎病发病机制奠定理论基础。

尖孢镰孢菌（GenBank accession number：MK764912）分离自甘肃定西马铃薯枯萎病发病根系^［14］。马铃薯品种为陇薯7号脱毒微型薯。

苹果酸和棕榈酸标准品都购自上海安谱实验科技股份有限公司，纯度分别为99.09%和99.00%。

蛭石在自来水中浸泡12 h后用蒸馏水洗3次，再用蒸汽灭菌。将直径16 cm、高15 cm塑料花盆用蒸馏水清洗3次，装入灭菌蛭石。陇薯7号脱毒微型薯用1%次氯酸钠溶液表面消毒5 min，在无菌蒸馏水中漂洗5次后种植于装入灭菌蛭石花盆中，然后将花盆放置于人工气候箱中，微型薯直接在清洁过的蛭石中生长发芽。发芽后马铃薯幼苗保持在25±2 ℃和65%相对湿度约30 d^［15］，每8 d补充Hoagland营养液250 mL^［16］，每4 d浇蒸馏水200 mL。30 d后马铃薯进入现蕾期，把马铃薯幼苗从花盆中掏出来，用自来水冲洗掉根系附着的蛭石。每5株马铃薯幼苗放入装有2 L超纯水的大烧杯中，全部根系置于水面下，放入人工气候箱（光照16 h，25±2 ℃）培养24 h。整个试验共15株马铃薯。培养完成后，把每组2 L的根系分泌物用一个100 mL Amberlite XAD-4大孔吸附树脂柱过滤，树脂使用之前按照说明书先预处理^［17］。然后把吸附树脂使用1 500 mL色谱级甲醇反复洗脱，最后把洗脱液在35 ℃下用旋蒸仪减压蒸发至100 mL，-80 ℃下保存备用。

参照张文明等^［18］收集方法并且略作改进，在甘肃定西长期连作定位试验田选择轮作、连作5年和连作10年的3个处理，每处理3个小区，现蕾期每个小区分别挖取马铃薯植株5株，每个处理共15株，把马铃薯根系表面黏附土壤反复抖动干净后，在现场用500 mL色谱级甲醇反复洗涤根系，把收集的根系分泌物4 000 r·min^-1离心5 min， 然后在35 ℃用旋蒸仪浓缩到100 mL，保存于-80 ℃冰箱内备用。

取样本1 mL于1.5 mL离心管中，在真空浓缩器中干燥提取物，向干燥后的代谢物加入60 μL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg·mL^-1），轻轻混匀后，放入烘箱中80 ℃下孵育30 min，向每个样品中加入80 μL BSTFA（双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺，含有1%TMCS（氯三甲基硅烷），v/v），将混合物70 ℃下孵育1.5 h；冷却至室温，向混合的样本中加入5 μL FAMEs（饱和脂肪酸甲酯，溶于氯仿），随机顺序上机检测。

Agilent 7890B气相色谱-飞行时间质谱（PEGASUS HT， LECO， 美国）联用仪配有Agilent DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm， J & W Scientific， Folsom，美国），以无分流模式注入1 μL等份样品。氦气作为载气，前入口吹扫流量为3 mL·min^-1，通过塔的气体流量为1 mL·min^-1。初始温度保持在50 ℃下1 min，然后以10 ℃·min^-1的速率升高到310 ℃，然后在310 ℃下保持8 min。注入、传输线和离子源温度分别为280、280、250 ℃。在电子碰撞模式下能量为-70 eV。在溶剂延迟6.25 min后，以每秒12.5光谱的速率在50—500 m·z^-1范围内以全扫描模式获得质谱数据。

使用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析^［19］。对物质定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。最后，将QC样本中检出率50%以下或RSD>30%的峰去除^［20］。

先用细菌过滤器把收集的连作马铃薯根系分泌物过滤后，在超净工作台上取250 μL涂布在PDA平板上，等待5 min，让根系分泌物入渗到培养基中；对照加等量的甲醇。共4个处理：对照、轮作、连作5年和连作10年，每个处理重复5次。用直径为0.5 cm的打孔器在尖孢镰孢菌菌落边缘打下菌饼，接种到上述培养皿中心位置，每皿接种1个菌饼，在培养箱（25 ℃）培养，分别在培养3、5、7 d测定菌落直径，并在7 d后刮取菌丝，测定鲜质量，计算化感效应指数（RI） ^［21］

分别用苹果酸和棕榈酸配置浓度为0.05、0.1、0.5 mmol·L^-1的甲醇溶液，在超净工作台上取250 μL配置液涂布在PDA平板培养基上，等待5 min，让溶液充分入渗到培养基中；对照加等量的甲醇。用打孔器取菌落边缘长势一致的菌丝，接入到经酚酸处理的PDA培养基中。在培养箱（25 ℃）培养，分别在培养3、5、7 d测定菌落直径。每个处理5个重复，以未加苹果酸和棕榈酸的处理作为对照。

以没有种植过茄科作物的土壤为基质，将马铃薯脱毒原原种播种于育苗钵中，幼苗生长至10 cm高，选取株高和长势一致的马铃薯苗进行处理。将收集到的连作马铃薯根系分泌物用细菌过滤器过滤后，每7 d加入25 mL根系分泌物原液，共添加4次。接种尖孢镰孢菌时，取长至满皿的菌种加无菌水制成浓度为1.0×10⁶ mL^-1悬液，接种在距马铃薯苗3 cm处用刀切断根系，深度切到盆底，苗子左右各一刀；把尖孢镰孢菌的悬浮液浇灌马铃薯切开的根系，每盆浇灌悬液25 mL。设只接种枯萎菌而不加根系分泌物原液处理为对照，10次重复。接种尖孢镰孢菌后15、30 d调查植株发病级别和病情指数。

盆栽实验育苗和尖孢镰孢菌的接种方法和1.2.7.1相同。苹果酸和棕榈酸处理浓度为0.05、0.1、0.5 mmol·L^-1，每7 d加入25 mL酚酸溶液，共添加4次。设只接种枯萎菌而不加苹果酸和棕榈酸处理为对照（CK），10次重复。接菌后进行正常的田间管理。 接种尖孢镰孢菌15、30 d调查植株病情指数。

应用IBM SPSS Statistics 19.0进行方差分析（ANOVA）；平均数比较应用Duncan多重比较法，显著水平为5%。

水培马铃薯根系分泌物总离子质谱图如图1，通过GC-TOF-MS质谱数据库纯化合物的比对，按照相似度大于850、峰面积大于50 000，得到水培马铃薯根系分泌的主要化合物有48种（表1），其中小分子有机酸占有30种，占总分泌物的62.5%。

轮作、连作5年和连作10年的马铃薯根系分泌物总离子质谱图见图2。通过GC-TOF-MS质谱数据库纯化合物的比对，按照相似度大于850、峰面积大于50 000，得到马铃薯根系分泌的主要化合物有52个（表2）。主要是有机酸类化合物，其中包含了马铃薯水培试验检测出的马铃薯全部根系分泌的48种化合物，其中大田试验多检测出4种化合物有可能来自土壤之中。

从图2看出，轮作、连作5年和10年的马铃薯分泌物的总离子质谱图基本相似，出峰时间接近，但峰的高度和面积不一样，差异比较大，说明不同连作年限的马铃薯根系分泌物种类基本相同，因为出峰时间相同；峰的高低和面积表示根系分泌物的相对含量不一样。表2表明，轮作、连作5年和10年3个处理马铃薯分泌的糖类物质中无水葡萄糖的相对丰度变化比较大。轮作、连作5年和10年无水葡萄糖相对丰度分别为12.64%、16.51%、21.53%。不同连作年限马铃薯根系分泌的酚酸物质中苹果酸和棕榈酸相对丰度变化最大，轮作、连作5年和10年苹果酸的相对丰度分别为3.52%、5.10%和7.76%；轮作、连作5年和10年棕榈酸的相对丰度分别为2.95%、4.00%和6.56%。其次变化差异大的还有富马酸、柠檬酸、乙醇酸、缬氨酸、焦谷氨酸、棕榈油酸、亚油酸等，但是变化幅度都小于苹果酸和棕榈酸。

总离子谱图通过计算机检索和GC-TOF-MS质谱数据库纯化合物的比对进行物质鉴定，是依据物质的相似度进行比对的，为了准确验证关键化合物的存在，应该再用标准品来进行验证。通过苹果酸和棕榈酸2种标准物质离子质谱图可以看出（图3），13.31、19.43 min出的两个峰分别为苹果酸和棕榈酸。在相同时间所出两个峰被计算机检索系统确定为苹果酸和棕榈酸，由此肯定马铃薯根系确实分泌苹果酸和棕榈酸。

由表3可以看出，轮作马铃薯根系分泌物收集液能促进尖孢镰孢菌菌丝的生长，但是与对照相比差异不显著。与对照相比，连作5年马铃薯根分泌物收集液显著地促进了尖孢镰孢菌菌丝生长，培养3、5、7 d促进生长率7.88%—9.26%；连作10年马铃薯根系分泌物收集液更加显著地促进尖孢镰孢菌菌丝的生长，培养3、5、7 d促进生长率11.24%—13.16%。与对照相比，马铃薯根系分泌物的收集液都显著增加了尖孢镰孢菌的菌丝鲜质量，连作10年的提高菌丝最大，其次连作5年，差异都达到显著水平。

从表4可以看出，与不加苹果酸的对照相比，加苹果酸能促进尖孢镰孢菌菌丝的生长，RI均为正值，但是当苹果酸浓度0—0.10 mmol·L^-1时，对尖孢镰孢菌菌丝的生长影响不显著；当浓度0.10—0.50 mmol·L^-1时，苹果酸对尖孢镰孢菌起到显著的促进作用，这说明苹果酸在低浓度对尖孢镰孢菌的促进作用不明显，而在高浓度表现出较强的促进作用。

与不加棕榈酸的对照相比，当棕榈酸的浓度0—0.10 mmol·L^-1时，RI均为正值，表明棕榈酸对尖孢镰孢菌生长有促进作用，当棕榈酸浓度0.05—0.10 mmol·L^-1时，棕榈酸对尖孢镰孢菌生长起到了显著的促进作用，但是棕榈酸浓度0.10—0.50 mmol·L^-1时，明显抑制尖孢镰孢菌生长，其中在0.50 mmol·L^-1浓度下培养到第5、7天时，RI表现为负值。这说明棕榈酸对尖孢镰孢菌生长在低浓度时是促进作用，高浓度时表现出明显抑制的化感作用。

由表5可知，马铃薯根系分泌物收集液对马铃薯枯萎病发病级别和病情指数都有促进作用。与对照相比，连作5年的马铃薯根系分泌物收集液显著地提高了马铃薯枯萎病的发病级别，连作10年的差异更加显著；但是轮作马铃薯根系分泌物收集液有提高枯萎病发病级别的趋势，差异却不显著。与对照相比，第15天轮作的病情指数增加2.5，继续生长到第30天病情指数增加5。连作5年的病情指数第5天增加8.5，继续生长到第30天病情指数增加12.5。连作10年的病情指数第5天增加20，继续生长到第30天病情指数增加27.5。这说明连作10年和5年马铃薯根系分泌物收集液能显著提高马铃薯枯萎病的发病级别和病情指数。

由表6可以看出，苹果酸和棕榈酸都能促进马铃薯枯萎病发病级别和病情指数增大。苹果酸和棕榈酸浓度0—0.05 mmol·L^-1时对枯萎病的发病级别有提高作用，但是差异不显著。当2种酚酸浓度0.05—0.50 mmol·L^-1时，对枯萎病的发病级别显著提高，浓度越高差异越大。病情指数随着2种酚酸浓度的增大而提高，浓度越高提高的幅度越大。这说明2种酚酸对马铃薯枯萎病有显著的促进作用。

小分子有机酸是植物生命活动的重要次生代谢产物，植物利用发达的根系分泌到土壤中去，为土壤中病原菌生长、活动、繁殖提供碳源，也为病原菌与寄主相互信息交流桥梁^［22］。植物根系分泌的大部分有机酸具有化感效应，土壤中植物根系分泌和代谢产物不断累积，达到一定的量并且影响植物种子萌发、生长、病原菌活动和微生物群落结构变化，进而发生自毒作用^［8，23］。自毒物质的研究集中在中药材、甜瓜、黄瓜、茄科作物茄子和番茄等作物上，引起自毒作用的有机酸主要有阿魏酸、苯甲酸、丁香酸、香草酸、香豆酸、水杨酸、肉桂酸、邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸等，这些有机酸抑制植物生长发育外还对土壤中微生物，尤其是病原菌生长具有促进化感效应，导致连作过程中土传病害发生和加剧^［8，24］。有关在茄科作物马铃薯自毒作用的研究成为近年来关注焦点，课题前期研究表明，在甘肃景泰灌区连作马铃薯的自毒物质邻苯二甲酸二丁酯和棕榈酸能促进立枯丝核菌生长和繁殖^{［18，25］}。近年来随着甘肃中部连作马铃薯枯萎病加剧^［5］，本试验对甘肃定西旱地连作马铃薯根系分泌物进行鉴定，首次发现苹果酸也对马铃薯具有自毒作用，能促进尖孢镰孢菌生长发育，提高枯萎病的病情指数；课题组在前期景泰灌区连作马铃薯中发现自毒物质棕榈酸只对立枯丝核菌具有化感促进作用^{［18，25］}，在本试验中明确发现棕榈酸在低浓度时也对尖孢镰孢菌生长具有促进作用，同样能提高马铃薯枯萎病的病情指数。

马铃薯根系分泌物中有机酸的鉴定对于控制土传病害、克服马铃薯连作障碍具有重要的理论意义^{［18，25］}。本研究色谱图中的其余未知峰和根系分泌物的有机酸与土壤微生物的关系等还需要进一步的深入研究。

马铃薯主产区甘肃定西连作重病田马铃薯枯萎病发病率高达到80%，连作马铃薯根系分泌物的48种物质中有机酸占30种。通过比较轮作、连作5年和连作10年处理有机酸的相对含量，发现苹果酸和棕榈酸的差异比较大。

马铃薯连作条件下根系分泌物能显著增强尖孢镰孢菌的发育并加重枯萎病病情指数。通过外源添加法研究苹果酸和棕榈酸对尖孢镰孢菌的化感作用，苹果酸0.10—0.50 mmol·L^-1浓度对尖孢镰孢菌生长起到显著的促进作用；棕榈酸浓度0.05—0.10 mmol·L^-1对尖孢镰孢菌生长起到了显著的促进作用。盆栽试验表明，苹果酸和棕榈酸在浓度0.05—0.50 mmol·L^-1内对马铃薯枯萎病有显著的促进作用。

苹果酸和棕榈酸是马铃薯根系分泌的化感自毒物质，对尖孢镰孢菌生长起促进作用是连作马铃薯枯萎病发病率高的主要原因。