土壤真菌具有丰富的物种、遗传和功能多样性，在陆地生态系统物质能量循环过程中发挥着重要的作用^［1］。土壤真菌可与寄主植物形成菌根共生体，能够显著提高寄主植物对于环境胁迫的抵抗力，增强生态系统适应性与生态弹性^［2］。腐生营养型真菌是植物残体、根系凋落物的主要分解者，其对有机化合物的分解和养分的矿化是土壤养分循环的关键过程^［3］。病理营养型真菌的大量富集则可能引发植物病害，是植被退化死亡的重要原因^［4］。另外，土壤真菌群落作为生物地球化学循环的重要驱动因素，显著影响着土壤质量^［5］。目前，解析土壤真菌群落结构与功能已经成为深入理解生态系统功能，评价土壤生态系统健康的重要基础。

一般来说，寄主植物偏好是森林生态系统土壤真菌群落构建的决定性因素；但对单一寄主而言，林龄则是塑造土壤真菌群落的重要因素^［6］。在不同林龄阶段，林木会招募特定的土壤真菌类群，应对病害发生、改变营养状况以及适应环境变化^［7］。同时，林木生长与老化过程中产生的凋落物和根系分泌物也是土壤真菌的重要养分来源^［8］，驱动着土壤真菌分布格局的变化^［9］。在局部尺度上，土壤真菌群落构建还受到外部非生物因子土壤条件的直接影响。国内外研究普遍证实，土壤真菌丰富度和多样性常受土壤pH、含水量和有机质含量等因素影响^［10］。此外，寄主植物和土壤环境的交互影响对于土壤真菌群落构建也存在不容忽视的影响^［11］。随林龄增加，林地土壤环境会发生显著改变，进而影响土壤真菌群落构建^［12］。因此，土壤真菌具有极强的环境敏感性，阐明其群落结构与功能的动态变化及其影响因素，对于深入理解土壤真菌群落构建具有重要意义。

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolia）是典型的菌根真菌依赖型树种，具有防风、抗旱和耐寒等优点，是中国北方风沙区引种种植范围最广的常绿针叶固沙造林树种^［13-14］。目前，樟子松人工林土壤真菌群落多样性已有广泛报道^［15］，但不同林龄樟子松人工林土壤真菌群落结构和功能特征的动态变化及其影响因素仍然尚不明确。鉴于此，本研究以科尔沁沙地樟子松人工林为研究对象，采用高通量测序技术，比较分析幼龄、中龄、近熟、成熟和过熟5个林龄阶段樟子松人工林土壤真菌群落结构和功能特征，并研究揭示其与林地土壤理化性质的关系。研究结果有助于深入理解土壤真菌群落构建机制，并为科学管理樟子松人工林和评价土壤健康提供理论依据。

研究区位于辽宁省阜新市彰武县的章古台沙地国家森林公园（42°42′N，122°29′E），地处科尔沁沙地的东南部，平均海拔226 m。该区属中温带亚湿润大陆性季风气候，年均气温8.2 ℃，昼夜温差大；年均降水量526.5 mm，降水分布不均，主要在6—8月；无霜期140~160 d，年平均日照2 615.2 h，光照充足。土壤类型以风沙土为主，有机质含量低。研究区内乔木树种有樟子松、油松（Pinus tabuliformis）、新疆杨（Populus bolleana）等，灌草植被有寸苔草（Cares duriuscula）、小叶鼠李（Rhamnus parvifolia）和鹅绒委陵菜（Potentilla anserine）等。

2019年7月，结合历史资料和实地踏勘，以科尔沁沙地幼龄林（13 a）、中龄林（22 a）、近熟林（34 a）、成熟林（41 a）和过熟林（55 a）5个龄组樟子松人工林为研究对象，选择立地条件和管理措施相同地段，在每个林龄林分内分别布设5块20 m×20 m试验样地，对樟子松人工林进行每木检尺（表1）。每块样地选取间隔10 m以上的3株标准木作为采样对象，采样时用铲子将树基周围2 m范围内的地表覆盖物铲除。用环刀采集土壤样本，采集深度0~20 cm，同时除去杂草和其他植物的根茎。将同一样地的3株标准木土壤样品充分混合，则每个林分有5个重复，混合后土壤样品分别装入塑料袋中，并将所挖出的新鲜非根际土壤分别标注标号包好。采集的土壤样本放置于-4 ℃便携保温盒中，72 h内带回实验室，放入-80 ℃冰箱中冷冻保存，以备后续样品处理。

土壤孔隙度（SP）和土壤含水量（SWC）采用环刀干燥称重法测定；速效磷（AP）和全磷（TP）采用碳酸氢钠浸提和钼锑抗比色法测定；速效钾（AK）采用乙酸铵浸提和火焰分光光度计测定；土壤pH值采用pH分析仪测定；土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾稀释热法测定；土壤铵态氮（NH4+-N）采用氯化钾溶液浸提和靛酚蓝比色法测定；土壤硝态氮（NO3--N）采用双波长紫外分光光度计法测定。

使用PowerSoil® DNA试剂盒（MO BIO公司）提取土壤样本中DNA，然后采用1%琼脂糖凝胶电泳法和光谱分析方法，对DNA进行浓度和质量分析。采用真菌通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTT-CATCGATGC-3'），对真菌rDNA ITS区段进行PCR扩增。混合PCR产物后，采用2%琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物，并通过AXYGEN公司AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。PCR扩增产物测序工作由北京奥维森生物技术有限公司使用Illumina MiSeq PE300高通量测序平台完成。PCR产物用于构建微生物多样性测序文库，将原始序列分析结果传到NCBI的SRA数据库（登录号PRJNA814484），将97%作为阈值把有效序列划分为可操作的分类单位。采用NCBI数据库BLAST分析方法，将Operational Taxonomic Units（OTU）中出现频率最高的序列作为OTUs的代表序列，并比较相似度大于≥97%的序列，同时与种群类型信息进行比较。若相似度大于≥97%可确定为种水平，若相似性为90%~97%，可确定为属水平^［16］。在FUNGuild数据库对樟子松人工林土壤真菌的营养型和功能群进行分类和鉴定^［17］，对置信度为“很可能”（probable）和“极可能”（highly probable）的划分结果进行保留。同时，将置信度为“可能”（possible）的划分结果与先前研究进行对比，以确定其功能类型。将具有复合营养型（trophic mode）或复合功能群（guild）的群落分别归纳为“其他营养型”和“其他病理/腐生/共生营养型”。

根据整个群落中真菌类群的占比划分优势度，优势属占比≥10%，常见属占比1%~10%，稀有属≤1%^［18］。利用SPSS 20进行数据处理与分析，包括最小显著差异法（LSD）和斯皮尔曼相关性检验（Spearman's rank correlation），显著性水平均为P<0.05。利用R 3.5.1软件，计算科尔沁沙地樟子松人工林土壤真菌的Simpson、Shannon、Pielou等多样性指标。采用Origin 2021进行相对丰度堆积图和热点图绘制。为了减少数据集中罕见OTU的数量，删除了相对丰度小于0.01%的OTU。用R 3.5.1中的“Hmisc”包用于计算相关性系数矩阵和P值矩阵，r≥0.7，P<0.05为物种存在相关关系的阈值，用Gephi-0.9.2软件实现网络可视化。应用Canoco for Windows 4.5进行土壤微生物群落结构和土壤物理化学特性的冗余分析（RDA）。

科尔沁沙地樟子松人工林土壤样品共获得922个OTUs。幼龄林土壤真菌Shannon和Simpson指数显著高于其他龄组（P<0.05），Pielou指数显著低于其他龄组（P<0.05）。但整体而言，林龄对土壤真菌多样性指数无显著影响（P>0.05，表2）。

科尔沁沙地樟子松人工林土壤真菌隶属14门25纲67目98科254属（图1）。从门水平来看，土壤真菌主要包括担子菌门Basidiomycota（47%）、子囊菌门Ascomycota（41.68%）和被孢霉门Mortierellomycota（5.53%）。随林龄增加，子囊菌门相对丰度先升高后降低，而担子菌门和被孢霉门则相反。在属水平上，土壤真菌优势属和常见属共有20属。其中，幼龄林、中龄林和近熟林优势属均为美口菌属Calostoma，成熟林和过熟林优势属为糙缘腺革菌属Amphinema。随林龄增加，土壤真菌优势属比例呈上升趋势，常见属呈下降趋势，稀有属则保持相对稳定。此外，幼龄林和近熟林、成熟林和过熟林聚合性较好，土壤真菌群落结构更为相似。且中龄林与幼龄林和近熟林结构更为相似，幼龄林和近熟林与成熟林和过熟林土壤真菌群落结构存在一定变异性。

科尔沁沙地樟子松人工林共生营养型真菌占比22.61%~55.12%，主要生态功能群是外生菌根真菌（图2）。随林龄增加，共生营养真菌、外生菌根真菌占比均呈先减小后增大趋势，且在成熟林中达到最小。腐生营养型真菌占比14.93%~28.60%，主要生态功能群是未定义腐生真菌。随林龄增加，腐生营养型真菌、未定义腐生真菌占比均呈先增大后减小趋势，且在成熟林中达到最大。病理营养型真菌所占比例为2.86%~5.20%，其主要生态功能群是动物病原菌。随林龄增加，病理营养型真菌、动物病原菌分布较为均匀，均在中龄林最大，近熟林最小。其他营养型真菌占比15.10%~34.96%，腐生-共生营养型真菌占主要部分（9.93%~16.72%）。

土壤真菌网络随林龄增加愈加复杂，且5个林龄的网络均呈模块化（modularity>0.4，图3）。随林龄增加，中龄林土壤真菌网络平均路径长度最大，平均聚类系数最小，表明其网络最为松散（表3）。随林龄增加，土壤真菌网络节点数量呈先减小后增大的趋势，边数和平均度均呈先增后减再增大趋势，且均在近熟林达到最小，表明该时期土壤真菌群落更简单，而过熟林最为复杂，成熟林次之。随林龄增加，土壤真菌群落之间的正相关呈波动增加趋势，幼林时期最小，成熟林达到最大。

随林龄增加，碱解氮、硝态氮、有效磷、全磷、有机质含量和pH总体呈先增大后减少的趋势（表4）。其中，除有效磷、pH外均在成熟林有小幅度下降，且幼龄林和过熟林中含量显著低于其他龄组（P<0.05）。随林龄增加，铵态氮、土壤含水量、毛管孔隙度呈先减后增再减小的趋势，全钾则呈先减小后增大趋势。同时，碱解氮、铵态氮、硝态氮、有机质、土壤含水量和毛管孔隙度均在成熟林达到最大值，且碱解氮、土壤含水量显著高于其他龄组（P<0.05）。

土壤真菌群落结构主要驱动因子排序为有机质（r²=0.685，P=0.0005）>pH值（r²=0.647，P=0.0005）>碱解氮（r²=0.526，P=0.0005）>硝态氮（r²=0.484，P=0.001，图4）。相关性热图仅列出与环境相关性较高的土壤真菌属，美口菌属与土壤含水量极显著负相关（P<0.01），与铵态氮含量显著负相关（P<0.05）。糙缘腺革菌属与土壤含水量极显著正相关（P<0.001），与铵态氮含量显著正相关（P<0.05）。Devriesia与铵态氮含量极显著正相关（P<0.001），与土壤含水量极显著正相关（P<0.01）。土壤真菌多样性与土壤理化性质无显著性相关性（P>0.05），腐生营养型真菌相对丰度与土壤有机质含量极显著正相关（P<0.01）。病理营养型真菌相对丰度与土壤pH显著负相关（P<0.05），与土壤全磷含量显著正相关（P<0.05）。其他土壤因子与3个营养型均无显著相关性（P>0.05，表5）。

科尔沁沙地樟子松人工林土壤真菌群落多样性指数总体并未受到林龄和土壤理化性质的显著影响，其与环境因子相关性较差，这可能因为土壤真菌种类丰富，土壤真菌群落对环境变化具有较强的适应性^［19］。但在幼林阶段，土壤真菌多样性指数与其他各林龄之间差异显著。这是因为林分早期土壤真菌物种数量的环境异质性和随机性较大，而在相对更稳定的环境条件下，土壤真菌的群落形成具有一定的收敛性^［20］。

土壤真菌群落结构受到林龄和土壤理化性质调控。担子菌门相对丰度在幼林时期较高，这是因为幼林时期养分较为缺乏，担子菌门内多数常见真菌与樟子松共生因占有较大比例^［15］。随林龄增加，子囊菌门相对丰度逐渐多于担子菌门，两菌门占比差异在前人研究中同样存在^［21］。这与子囊菌较担子菌适应性更强、进化速度更快有关，且子囊菌的存在更有利于增加土壤养分含量和可利用率。成熟林和过熟林时期，土壤真菌群落聚合性较好，结构也更为相似。随林龄增加，土壤真菌群落同质性和结构稳定性在逐渐增加，演替后期趋于相似^［22］。林分老化过程中土壤理化性质也会随之改变。土壤真菌群落结构主要受到土壤有机质、pH、碱解氮和硝态氮的驱动，早前研究也证实土壤碳氮比、pH和水分是驱动土壤微生物结构的关键因素^［23］，碳、氮等资源的可用性直接影响微生物群落活动^［24］。真菌优势属美口菌属、糙缘腺革菌属和常见属Devriesia等均与土壤含水量呈显著相关性，土壤含水量是影响土壤真菌群落组成的重要因素。

各龄组土壤真菌OTU的连接大多数是正相关，而幼林时期，负相关比例占比最大，负相关的存在有利于促进真菌网络稳定^［25］，土壤真菌群落偏好构建复杂生态网络来共存^［23］。土壤真菌网络随林龄增加愈加复杂，主要表现在成熟林和过熟林时期。随林龄增加，成熟林土壤肥沃，有机质、氮含量达到最大，土壤真菌活性增加、群落更加复杂，其对环境变化的适应能力增加^［26］。一般而言，土壤微生物结构越复杂，土壤生态系统越稳定，森林生态系统功能随之越高，对外部环境变化抵抗能力越强。

土壤真菌是顽固植物残留物的主要分解者，其具有不同生命策略和底物偏好。随林分老化土壤真菌对特定物质的分解更加专业化和高效^［27］，因而生态位分化较强烈。幼林至近熟林时期，共生营养型真菌占比最大，一是因为林木早期阶段外生菌根真菌有较强的寄主偏好性，二是幼林时期土壤中有机质和氮含量最低，樟子松对营养物质的需求较大，招募了大量外生菌根真菌来促进寄主对养分的吸收。此外，在不同营养型真菌之间存在相互制约，共生营养型真菌的大量富集会对植物病原菌产生拮抗作用，进而减少了病原菌的定植，对樟子松生长起到积极作用^［28］。随着人工林成熟，腐生营养型真菌在成熟林大量富集，凋落物和坏死组织数量增加，为腐生菌提供了有机物质池。腐生营养型真菌对凋落物进行分解后根际会释放出更容易获取的碳源，此时土壤中氮含量和有机质也达到最大值，这表明特定真菌类群对凋落物的分解作用变得高效^［29-30］，土壤养分更加肥沃。结果表明，土壤真菌通过调节其生态策略和行为，在沙地樟子松人工林不同林分阶段表现出不同的分布模式，说明其与土壤养分状况及生态系统稳定密切相关。

土壤真菌功能类型与土壤理化性质关系复杂，土壤真菌可以通过自身生理活动影响土壤生态系统健康与稳定，还可以通过影响植物群落生长状态间接影响，而植物群落和土壤性质反过来又可以决定真菌群落功能组成，从而产生三方反馈关系^［31］。本研究中，腐生营养型真菌相对丰度与土壤有机质含量为极显著正相关，土壤有机质是腐生营养型真菌的主要养分来源，有机质分解难易程度也决定了土壤真菌分布和组成^［32］。土壤pH与土壤病理营养型真菌有显著负相关关系，与前人结果一致^［22］。土壤真菌对林分发育引起的土壤pH变化敏感，pH对塑造土壤真菌功能特征意义重大。全磷含量与病理营养型真菌呈显著正相关关系，随林龄增加，土壤养分磷含量出现积累，土壤中的磷含量是微生物活动的驱动因素。但土壤理化因子与共生营养型真菌均无显著相关性，共生营养型中的外生菌根具有宿主特异性，宿主特异性对其影响更大^［33］。由此可见，土壤理化因子对真菌群落功能特征塑造起着关键作用。

土壤真菌作为土壤微生物的重要组成部分，具有良好的适应能力，可以广泛存在荒漠中且具有重要的生态功能^［34］。土壤真菌多样性指数是代表群落稳定性的重要指标，高多样性意味着生态系统的稳定以及真菌群落功能的健全^［35］。不同林龄林分中，科尔沁沙地土壤真菌的多样性指数总体无显著性差异，表现出一定适应性和稳定性，对樟子松人工林的生长发育有积极影响。子囊菌门和担子菌门均在各龄组森林土壤中占据优势地位，担子菌门种类繁多，且大多数已知的外生菌根真菌都是担子菌门，对沙漠生态恢复做出了巨大贡献^［19］，子囊菌门具有较高物种多样性，其中包含的大量腐生真菌能提高土壤养分含量和利用率，也更适于在干旱沙漠环境中生存。随林龄增加，土壤真菌优势属比例呈上升趋势，这可能是生态功能增强的重要原因，进而有利于树木快速生长^［22］。

随着樟子松人工林的成熟，土壤真菌群落复杂性和稳定性增加，有利于提升其对环境变化的适应性。土壤真菌对土壤理化性质变化敏感，不同土壤真菌属和营养型与土壤因子之间的相关性存在差异，说明土壤真菌在养分循环中发挥着重要作用。因此，可以合理地推测，依据不同林分阶段土壤真菌群落分布模式有助于我们针对性改善土壤养分含量。另外，外生菌根真菌与寄主植物之间的相互作用是研究樟子松人工林退化问题的一个潜在但关键的指标^［14］。土壤真菌分布不均可用植物不同阶段的生长及其带来的土壤环境变化解释，某些真菌属的富集或缺失可能是推测植物健康或疾病的重要因素^［9］。综上所述，不同林分阶段土壤真菌群落变化可以作为预测生态系统稳定性的重要指标。

随林龄增加，不同林分阶段土壤真菌群落结构和功能特征存在差异。科尔沁沙地樟子松人工林幼林至近熟林阶段，共生营养型真菌大量富集是因为其寄主偏好性较强，能促进林木对养分吸收及与其他营养型之间存在制约，进而有利于林木快速生长。成熟林和过熟林阶段，土壤真菌群落聚合性较好、结构相似；腐生营养型真菌分解作用更为专业化和高效，土壤养分更加肥沃；土壤真菌网络更为复杂并逐渐趋于稳定，有利于增强林木对外界环境的抵抗能力。土壤真菌群落对土壤理化性质变化敏感，土壤有机质、pH、碱解氮和硝态氮是土壤真菌群落结构的主要驱动因子，有机质与腐生营养型真菌呈极显著正相关，土壤全磷、pH与腐生营养型真菌分别呈显著正、负相关。综上所述，土壤真菌群落结构和功能特征反映了人工林生长发育状况及土壤养分变化，可为科尔沁沙地樟子松人工林经营管理和从土壤真菌视角评价土壤健康提供理论依据。