沙蓬（Agriophyllum squarrosum）是藜科一年生草本植物，具有耐贫瘠、种子萌发快、生长迅速、生长期短等特性，是沙漠植物定居的开拓者，为其他植物种在恶劣环境下入侵和定居提供条件^［1］。沙蓬种子具有非常高的营养价值，蛋白含量高达23%，包含了人类日常饮食所需的所有必需氨基酸，营养价值堪比联合国粮农组织推荐的全营养食物藜麦，且沙蓬蛋白质氨基酸模式与人体蛋白质氨基酸模式接近^［2-3］。此外，还有研究者用化学和生物学相结合的方法研究了沙蓬种子蛋白的营养价值，其蛋白质功效比值、真消化率、生物价、净利用率分别为0.93、89.21%、87.33%、78.24^［4］，说明沙蓬种子蛋白质营养价值较高（表1），是一种具有广阔前景的蛋白质资源。

植物蛋白质的合成离不开土壤氮素的供给，土壤氮素水平又影响着土壤生态系统的生产力和可持续性。沙漠土壤贫瘠，植被稀疏，生物固氮是沙漠生态系统中氮素来源的重要途径，固氮微生物群落组成和多样性直接影响着土壤氮素的循环。根际微生物组在植物营养和健康方面发挥积极作用^［7-8］。植物能够通过根系分泌物改变根际土壤理化性质影响微生物的活性^［9-10］，从而招募或召唤特定微生物类群产生有益于宿主自身的微生物群落^［11-12］，并对植物行使一系列关键的生态服务功能。特定的环境胁迫下，如磷或铁元素的缺乏会导致一些植物倾向于增加柠檬酸、苹果酸或草酸的分泌，以丰富根际有机碳来吸引有益微生物^［13］。而在不同发育阶段，植物还可通过特殊根系分泌物的释放，将少数为植物提供特殊需求的微生物招募至根际，从而满足植物的特殊需求^［14-15］。拟南芥不同发育阶段（幼苗期、营养期、抽薹期和开花期）根际微生物群落具有显著差异，Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria和特定属与根系分泌物类型极显著正相关^［14］；小麦在苗期、分蘖期和开花期根际微生物物种组成相对稳定，而在成熟期发生了显著性变化，说明根际微生物群落的构建不是随机的，而是根据植物不同发育阶段的特殊需求有针对性变化的^［16］。

固氮菌作为土壤中重要的功能类群，不仅调控着土壤中的氮素循环，还对植物的生长发育起着决定性作用，尤其是固沙先锋植物。李剑锋等^［17］证实了沙蓬内生固氮菌能够通过固氮作用和分泌有机酸的解磷作用促进沙蓬根际沙土中氮素和有效磷的积累，促进沙蓬适应沙漠严酷生境。沙蓬由萌发到开花结实再到枯朽，对土壤氮素的需求截然不同，那么，沙蓬在不同发育阶段是否存在着特殊的根际固氮菌群落满足其对氮素的多种需求呢？本研究选用nifH作为分子标记基因，以沙蓬不同发育阶段（幼苗期、营养生长期、生殖生长期和立枯期）根际土壤为研究对象，通过根际土壤固氮菌群落结构、差异物种以及土壤养分状况差异分析，明确沙蓬不同发育阶段根际固氮菌多样性特征，以期为深入探索沙漠生境中固沙先锋植物根际微生物与宿主之间的互作关系奠定基础，为荒漠植被恢复以及沙产业氮肥施用技术提供理论指导。

研究区（40°16′57"N、109°49′19"E，海拔1 002 m）位于库布齐沙漠东部鄂尔多斯市达拉特旗展旦召苏木乡。本区属于中温带大陆性季风气候，年平均降水量312 mm，年平均蒸发量2 160 mm，极端最高气温40.2 ℃，极端最低气温-34.5 ℃，≥10 ℃积温3 197.4 ℃，无霜期130~140 d。研究地为流动沙丘，主要天然植被为沙蓬，并伴有少量虫实（Corispermum sp.）和油蒿（Artemisia ordosica）。

2021年7月下旬、8月中旬、9月中旬和11月上旬分别采集沙蓬幼苗期（M）、营养生长期（Y）、生殖生长期（S）和立枯期（L）根际土壤样品（图1）。随机选取特定发育阶段的沙蓬20~30株（幼苗期沙蓬植株较小，携带根际土壤极其有限，选取50~100株），挖出沙蓬根系，抖掉与根系结合松散的土壤，然后将根轻轻放入无菌采样袋中，抖落附着在植物根系表面的土壤，并在无菌采样袋外拍打，直至根际土壤落净，最后将采集的根际土壤装入无菌自封袋中，置于4 ℃车载冰箱中保存，每个发育阶段分别采集15份土壤样品，共计60份。将土壤样品带回实验室，将一部分土壤样品置于-80 ℃冰箱中用于固氮菌高通量测序分析，另一部分土壤样品风干过筛后，测定土壤养分指标。

土壤养分的测定参考鲍士旦^［18］的方法，采用H₂SO₄-K₂Cr₂O₇稀释热法测定土壤有机质（OM）含量；采用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法测定速效磷（AP）含量；采用Solarbio土壤速效钾检测试剂盒测定速效钾（AK）含量；采用碱解扩散法测定速效氮（AN）含量；采用南京建成生物工程研究所的土壤蔗糖酶试剂盒、土壤脲酶试剂盒、中性蛋白酶试剂盒、中性磷酸酶试剂盒和过氧化氢酶试剂盒分别测定土壤蔗糖酶活性（Su）、脲酶活性（Ur）、中性蛋白酶活性（Pr）、中性磷酸酶活性（Ph）和过氧化氢酶活性（Ca），酶活性测定均采用微量法。

依照Tiangen Biotech公司“genomic DNA isolation kit”试剂盒说明提取土壤微生物群落总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测待测DNA的纯度，用C₂₁H₁₂BrN₃染色后在Nanodrop 2000凝胶成像系统进行检测。使用引物nifH-F（5'-AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC-3'）和nifH-R（5'-TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT-3'）对固氮菌nifH基因进行扩增。扩增步骤为：95 ℃下预变性10 min后，95 ℃变性5 s，50 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸40 s，循环40次。各样本重复3次。将扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测同一样本的PCR混合产物，回收扩增产物并对其进行纯化、检测和定量，之后进行高通量测序。

使用FLASH（V1.2.7，http： //ccb.jhu.edu/soft-ware/FLASH/）将测序所得的原始序列拼接，再通过QIIME软件将获得的序列按最小样本序列数抽平后进行生物信息学分析。采用UPARSE软件在97%相似水平上进行聚类并产生OTU（Operational Taxonomic Units，操作分类单元），并基于FGR数据库进行各样本在不同分类水平下的群落组成统计，以上过程均委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

采用SPSS 21.0、Origin 2017和R软件对土壤指标和固氮菌群落多样性进行分析，利用单因素（ANOVA）方差分析和多重比较进行差异显著性分析，基于Kruskal-Wallis秩和检验评估不同样本间物种差异显著性。主坐标分析、冗余分析和热图分析借助上海美吉公司I-Sanger云平台进行，并利用Adobe Illustrator 2020对图片进行修饰。

在不同发育阶段，沙蓬根际土壤养分变化差异显著（表2）。在M期，蔗糖酶活性较Y、S、L期显著提高，分别高50.50%、87.65%、40.74%；脲酶活性较S、L期显著提高，分别高47.90%、12.38%；过氧化氢酶活性仅较S期显著提高8.69%。在Y期，参与氮循环的速效氮含量、中性蛋白酶活性和脲酶活性均具有最高值，且速效氮含量和中性蛋白酶活性显著高于M、S、L期；速效氮含量较M、S、L期分别高16.24%、82.66%、30.27%，中性蛋白酶活性较M、S、L期分别高128.84%、115.34%、1190.57%；脲酶活性在Y期显著高于S、L期，分别高53.01%和16.26%。在S期，土壤速效氮、速效钾含量以及蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性较其他3个时期显著降低。在L期，沙蓬根际土壤速效磷、速效钾含量较其他3个时期显著提高，中性蛋白酶活性显著降低，说明在沙蓬生育期根际土壤中易被植物利用的磷、钾养分较低，能够催化有机氮水解的中性蛋白酶活性较高，生育期结束后，根际土壤中有机氮水解速率显著下降。

在沙蓬不同发育阶段，根际土壤固氮菌Coverage指数为0.997~0.999（图2），说明本次测序结果能够代表样本的真实情况。Chao指数在沙蓬4个生长时期无明显变化，说明根际固氮菌在沙蓬不同发育阶段的丰度无显著差别。Shannon指数和Shannoneven指数在不同时期虽然无显著变化，但可以看出在Y期明显升高。

bray-curtis相似性距离矩阵的主坐标分析结果显示，第一轴样本组成差异解释度为58.83%，第二轴样本组成差异解释度为16.33%，共解释固氮菌群落变异的75.16%（图3）。在沙蓬不同发育阶段，沙蓬根际土壤固氮菌群落结构存在显著差异（R=0.2971，P=0.001）。S期分布较为集中，其次是L期，说明在沙蓬生殖生长阶段，其根际固氮菌群落相对单一，L期有所改变，但仍然单一。Y期分布相对分散，说明沙蓬营养生长阶段根际固氮菌多样性显著提高，其次为M期。

固氮菌nifH基因高通量测序结果表明，沙蓬根际土壤固氮菌共获得7门12纲22目29科36属。沙蓬不同发育阶段根际土壤固氮菌纲水平相对丰度>1.00%的有4纲，分别为β-变形菌纲（β-Proteobacteria）、未分类细菌、α-变形菌纲（α-Proteobacteria）和γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）；相对丰度大于40%的固氮菌群落分布在β-变形菌纲，为44.30%~90.51%；未分类细菌、α-变形菌纲和γ-变形菌纲的相对丰度分别为0.83%~35.97%、7.98%~28.35%和0~1.14%（图4）。很明显，β-变形菌纲的相对丰度在S期显著（P<0.05）提高，其次为L期，说明沙蓬在S期和L期的根际固氮菌群落相对单一，主要为β-变形菌纲细菌；而在M期和Y期固氮菌多样性较高，β-变形菌纲、未分类细菌和α-变形菌纲分布相对均匀；尤其是Y期，出现了一定比例的γ-变形菌纲的固氮细菌，说明Y期的固氮菌种类相对丰富。

沙蓬根际固氮菌群落属水平相对丰度大于1.00%的有11种（图5），分别为广泛固氮氢自养单胞菌属（Azohydromonas）、未分类细菌、斯克尔曼氏菌属（Skermanella）、未分类伯克氏菌目、未分类根瘤菌目、未分类α-变形菌纲、未分类变形菌门、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、固氮弧菌属（Azoarcus）和未命名丰祐菌科。可以看出，广泛固氮氢自养单胞菌属是沙蓬根际的主要固氮菌类群，在M、Y、S和L期分别为35.05%、38.84%、72.89%和61.15%。斯克尔曼氏菌仅在Y期分布较多，为22.01%，在M、S和L期仅分布7.98%、5.22%和7.03%；慢生根瘤菌属仅在S期分布较多，分别是M、L期的3.56、8.58倍，在Y期未出现；类芽孢杆菌在M期分布较多，分别是Y、L期的16.52、6.86倍，在S期未出现；固氮弧菌属在M期分布较多，分别是Y、S、L期的4.83、17.62、35.94倍。由此可知，沙蓬不同发育阶段根际固氮菌群落存在明显差异。

基于Kruskal-Wallis秩和检验评估不同样本间固氮菌群的差异显著性，可知广泛固氮氢自养单胞菌属、未分类的细菌、斯克尔曼氏菌和未分类的伯克氏菌目在沙蓬M、Y、S和L期的分布具有极显著性差异，其次为慢生根瘤菌属和未分类的变形菌门（图6），说明沙蓬不同发育阶段根际固氮菌群落存在显著差异。

利用方差膨胀因子分析（Variance inflation factor，VIF）筛选保留共线性较小的环境因子，结合冗余分析（Redundancy analysis，RDA），分析环境因子对不同样本固氮菌群落结构的影响。方差膨胀因子分析（VIF默认值为10）筛选获得有机质含量（VIF为6.04）、蔗糖酶活性（VIF为2.49）、中性蛋白酶活性（VIF为3.50）、速效磷含量（VIF为5.98）、中性磷酸酶活性（VIF为4.35）和过氧化氢酶活性（VIF为7.73）6个土壤因子参数用于冗余分析。两个冗余分析成分的变异贡献率为36.37%，其中第一主成分贡献率为31.74%，第二主成分贡献率为4.63%（图7）。与第一主成分呈正相关的主要影响因子为有机质含量（0.84），以及蔗糖酶（0.94）、中性蛋白酶（0.65）、中性磷酸酶（0.89）、过氧化氢酶（0.99）活性。结合环境因子箭头长度和两个轴的夹角，与固氮菌群落具有显著相关性的土壤养分因子为中性磷酸酶活性（R²=0.53，P<0.01）、有机质含量（R²=0.38，P<0.01）和蔗糖酶活性（R²=0.31，P<0.01）。

通过热图进一步将相对丰度TOP20的属与环境因子进行分析，中性磷酸酶活性、有机质含量和蔗糖酶活性为主要的影响固氮菌群落的环境因子，其次为过氧化氢酶活性、速效磷含量和中性蛋白酶活性。已分类、已命名的固氮菌中，广泛固氮氢自养单胞菌属和慢生根瘤菌属与土壤有机质含量、中性磷酸酶活性和过氧化氢酶活性呈显著负相关，此两种固氮菌可能更适宜在碳、磷源贫瘠的土壤生存，在养分匮乏的土壤中发挥固氮作用。斯克尔曼氏菌属与中性蛋白酶活性、有机质含量和中性磷酸酶活性呈显著正相关；克雷伯菌属（Klebsiella）与中性蛋白酶活性和有机质含量呈显著正相关；类芽孢杆菌属与蔗糖酶活性呈显著正相关，该结果说明斯克尔曼氏菌属、克雷伯菌属和类芽孢杆菌属可能更适应富营养环境（图8）。

植物在不同发育阶段通过改变根系分泌物招募特殊类群的微生物是合理配置有限资源的关键生活史对策^［11-12］，是建立适应环境胁迫的权衡和补偿响应机制。本研究发现，沙蓬不同发育阶段根际固氮菌群落存在显著差异，但变形菌门（α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲）和广泛固氮氢自养单胞菌属在沙蓬完整生育期中均是主要的固氮菌类群。变形菌门细菌属于快速生长型细菌，变形菌门的固氮菌类群具有广泛的生态位和适生温度^［19］，能够在低碳环境中生长和繁殖，当贫瘠的土壤中外源养分输入增加时，快速生长型细菌会迅速繁殖占领生态位^［20］。本研究地为库布齐沙漠流动沙丘，风蚀沙埋、土壤贫瘠是流动沙丘土壤的主要特征，当固沙先锋植物定居时，其根系分泌物丰富了根际土壤中的养分，促进了快速生长的变形菌门细菌的生长。在属水平，广泛固氮氢自养单胞菌属为沙蓬根际优势固氮细菌属。魏庐潞等^［21］在小叶锦鸡儿（Caragana microphylla）、中间锦鸡儿（Caragana liouana）和荒漠锦鸡儿（Caragana roborovskyi）根际发现广泛固氮氢自养单胞菌属为优势固氮菌；史策等^［22］在油松林、针阔混交林、核桃楸林和蒙古栎林进一步证实了广泛固氮氢自养单胞菌属为核心固氮菌。本研究中广泛固氮氢自养单胞菌属与土壤有机质含量、中性磷酸酶活性和过氧化氢酶活性呈显著负相关关系，也说明自养型的广泛固氮氢自养单胞菌属可能更适应贫瘠土壤环境，有利于在流动沙丘成为固沙先锋植物根际优势固氮菌类群。

植物将光合产物以根系分泌物的形式释放至根际土壤供给根际微域微生物碳源和能源；根际微生物作为分解者和转化者将有机养分转化成无机养分供给宿主植物吸收和利用，这种植物-微生物互作在荒漠生态系统中，尤其是流沙环境中对维持植物群落稳定发展和生态系统良性循环至关重要。陈龙池等^［23］指出，植物不同发育阶段所处的生理状态不同，根系分泌物的种类和数量也随之变化；而植物不同发育阶段所释放的不同类型的根系分泌物，能够将少数为植物提供特殊需求的微生物招募至根际，从而满足植物的特殊需求^［14-15］。箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum）在药材稳定期的根际微生物群落结构与花蕾期、盛花期、果实膨大期和盛果期显著不同^［24］。本研究中，广泛固氮氢自养单胞菌属、斯克尔曼氏菌属、未分类的伯克氏菌目、慢生根瘤菌属和未分类变形菌门在沙蓬不同发育阶段的分布具有显著性差异，可能由于沙蓬不同发育阶段所需的营养物质组成和数量不同，导致了根际固氮菌的差异；相反，根际固氮菌群落也会对沙蓬生理代谢、生长发育等产生重要影响。

本研究中，斯克尔曼氏菌属在沙蓬营养生长期显著升高，发育至生殖生长期，斯克尔曼氏菌属丰度显著降低，并出现了慢生根瘤菌属。斯克尔曼氏菌为革兰氏阴性、杆状、具运动性，但不能固氮^［25］。而慢生根瘤菌属可以在宿主植物根部形成膨大的根瘤，通过自身固氮作用为宿主植物提供可利用氮素，或将空气中的氮气转化回归至土壤中^［26］。但沙蓬为藜科，未有研究证明慢生根瘤菌属能与沙蓬共生结瘤固氮。于艳霞等^［27］发现，华癸中慢生根瘤菌自生时或与紫云英共生时均发挥了重要的固氮功能；Terakado-Tonooka等^［28］将慢生根瘤菌接种于甘薯根际，明显提高了甘薯鲜重，并检测到了乙炔还原活性，说明慢生根瘤菌自生时表达了固氮酶活性，可为宿主植物提供氮源。慢生根瘤菌在沙蓬生殖生长期显著升高，可能是沙蓬生殖生长期需要更多的氮源供给自身干物质积累，导致根际土壤养分含量迅速降低（表2），从而引起根际化能自养型慢生根瘤菌^［29］丰度的显著升高；慢生根瘤菌还具有很强的二氧化碳固定能力^［30］，其在沙蓬根际不仅能为宿主提供丰富的氮源，还可补充根际土壤中的碳源。沙蓬生殖生长期干物质快速积累导致土壤中养分急剧降低，根际固氮菌争夺生态位发生激烈竞争，慢生根瘤菌由于化能自养且能为宿主植物提供更多的碳、氮源，可能是其在沙蓬生殖生长期显著升高的重要原因。为此，我们进一步测定了沙蓬幼苗期、营养生长期和生殖生长期植株体的干鲜比，分别为22.50%、25.76%和46.92%，在P<0.01水平上，生殖生长期沙蓬植株体的干鲜比显著高于幼苗期和营养生长期，说明在生殖生长期沙蓬确实积累了大量的干物质，也进一步证实了我们的推测。

此外，研究发现在沙蓬营养生长期根际土壤参与氮循环的速效氮含量、中性蛋白酶活性和脲酶活性均具有最高值，且速效氮含量和中性蛋白酶在营养生长期显著高于其他时期；营养生长期沙蓬根际固氮菌种类也更丰富。土壤微生物是物质和能量循环的驱动力，有益微生物作用于植物根际不仅能促进植物在恶劣环境下的定植和对养分、水分的吸收，还能通过分泌胞外酶、多糖等物质促进根际微域功能活性^［31］。沙蓬幼苗期和营养生长期干鲜比值在P<0.01水平上无显著差异，因此，我们认为沙蓬在流沙稳定定植后，首先通过招募多种固氮菌完成根际微域氮素的蓄积，这也是沙蓬营养生长期的主要任务；而发育至生殖生长期，主要以根际微域养分消耗为主，继而导致根际固氮菌的营养竞争性演替。本研究仅在沙蓬根际固氮菌群落结构方面进行研究，未来可深入研究沙漠生境中氮气-植物-根际土壤中的循环和转化、固沙先锋植物种群恢复与其根际微生物之间的互作机制等。

沙蓬为流动沙丘固沙先锋植物，具有耐风蚀沙埋和贫瘠干旱的优良特性，广泛分布于中国北方干旱、半干旱沙区。由于沙蓬生长环境长期遭受风蚀沙埋扰动，其根际固氮菌主要以快速生长型的变形菌门为主，其中包括α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲；又因风沙土瘠薄，其根际以自养型的广泛固氮氢自养单胞菌属为优势固氮属。

沙蓬不同发育阶段赋予其自身的使命不同，导致根际固氮菌群落结构具有显著性差异；幼苗期和营养生长期以定植和养分蓄积为主，其根际固氮菌多样性高，促进了根际微域参与碳、氮循环的蔗糖酶含量、有机质含量、速效氮含量、中性蛋白酶活性和脲酶活性显著升高；生殖生长期以自身植株体干物质积累和结实高蛋白种子为主，大量消耗土壤中蓄积的养分，直接导致根际固氮菌所需养分供给不足，迫使固氮菌产生营养竞争；而这种条件下，既能为自身提供营养又能为宿主提供养分的自养型慢生根瘤菌更易占领有限的根际生存空间，进而引起生殖生长期慢生根瘤菌丰度显著升高，促进了沙蓬根际固氮菌群落由异养型向自养型转变；进一步说明沙蓬根际固氮菌通过群落演替满足沙蓬不同发育阶段的特殊需求。