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中国沙漠, 2024, 44(6): 48-57 doi: 10.7522/j.issn.1000-694X.2024.00063

羽毛针禾（ Stipagrostis pennata ）阿拉伯呋喃糖苷酶基因 SpARAF1 的克隆与表达

尹珊,1, 唐蕊1, 尹清乐1, 王斐1,2,3, 李榕,1,2,3, 李鸿彬1,2,3

1.石河子大学，生命科学学院，新疆 石河子 832003

2.石河子大学，绿洲城镇与山盆系统生态兵团重点实验室，新疆 石河子 832003

3.石河子大学，新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832003

Cloning and expression of Alpha-L-Arabinofuranosidases Gene SpARAF1 from Stipagrostis pennata

Yin Shan,1, Tang Rui1, Yin Qingle1, Wang Fei1,2,3, Li Rong,1,2,3, Li Hongbin1,2,3

1.College of Life Science /, Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China

2.Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Oasis Town and Mountain-basin System Ecology /, Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China

3.Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization of Ministry of Education, Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China

通讯作者: 李榕（E-mail： lirong@shzu.edu.cn）

收稿日期: 2024-01-19   修回日期: 2024-06-02  

基金资助: 国家自然科学基金项目.  32060082
兵团自然科学支持计划项目.  2024DA061
石河子大学高层次人才科研启动项目.  校20220078
兵团科技计划项目.  2020BC002
石河子大学科技计划项目.  KX008505
促进与加拿大、澳大利亚、新西兰及拉美地区科研合作与高层次人才培养项目

Received: 2024-01-19   Revised: 2024-06-02  

作者简介 About authors

尹珊（2001—），女，甘肃张掖人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学E-mail：17793637010@163.com , E-mail：17793637010@163.com

摘要

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（Alpha-L-Arabinofuranosidase ARAF）在植物细胞壁形成和逆境胁迫响应中发挥着重要作用，为了探究该基因参与羽毛针禾（Stipagrostis pennata）抵御非生物胁迫和影响其根部沙套发育的机制及功能，本研究以沙漠植物羽毛针禾为对象，克隆得到SpARAF1基因并对其进行生物信息学、亚细胞定位和实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）分析。结果表明：羽毛针禾SpARAF1基因编码区序列全长为1 173 bp，编码391个氨基酸的亲水性无跨膜结构的蛋白，相对分子质量为43.3 kD。该基因编码的蛋白属于Alpha-L-AF-C超家族，与水稻和玉米亲缘关系较近。亚细胞定位显示SpARAF1定位在细胞壁。qRT-PCR结果显示SpARAF1基因的表达显著受到盐、干旱和高温等非生物胁迫的诱导，表明该基因参与羽毛针禾对非生物胁迫的响应过程。蛋白质互作预测分析显示SpARAF1与碳水化合物激酶和聚半乳糖醛酸酶存在可能的相互作用。

关键词： 羽毛针禾（Stipagrostis pennata） ; SpARAF1 ; 阿拉伯呋喃糖苷酶 ; 非生物胁迫 ; 亚细胞定位

Abstract

Alpha-L-Arabinofuranosidase （ARAF） plays an important role in plant cell wall formation and response to stress. In order to explore the mechanism and function of gene involved in resistance to abiotic stress and influence on the development of root sand jacket in grass. In this study， SpARAF1 gene was cloned and analyzed by bioinformatics， subcellular localization and real-time fluorescence quantitative PCR. The total length of SpARAF1 coding region is 1 173 bp， encoding 391 amino acids hydrophilic non-transmembrane protein， the relative molecular weight is 43.3 kD. Phylogenetic analysis showed that the protein encoded by this gene belongs to the Alpha-L-AF-C superfamily and is closely related to rice and maize. Subcellular localization showed that SpARAF1 was localized in the cell wall. The results of qRT-PCR showed that the expression of SpARAF1 was significantly induced by abiotic stress such as salt， drought and high temperature， which indicated that SpARAF1 was involved in the response process of Stipagrostis pennata to abiotic stress. Protein interaction prediction analysis showed that SpARAF1 may interact with carbohydrate kinase and polygalacturonase.

Keywords： Stipagrostis pennata ; SpARAF1 ; Alpha-L-Arabinofuranosidase ; abiotic stress ; subcellular loclization

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本文引用格式

尹珊, 唐蕊, 尹清乐, 王斐, 李榕, 李鸿彬. 羽毛针禾（ Stipagrostis pennata ）阿拉伯呋喃糖苷酶基因 SpARAF1 的克隆与表达. 中国沙漠[J], 2024, 44(6): 48-57 doi:10.7522/j.issn.1000-694X.2024.00063

Yin Shan, Tang Rui, Yin Qingle, Wang Fei, Li Rong, Li Hongbin. Cloning and expression of Alpha-L-Arabinofuranosidases Gene SpARAF1 from Stipagrostis pennata. Journal of Desert Research[J], 2024, 44(6): 48-57 doi:10.7522/j.issn.1000-694X.2024.00063

0 引言

近年来，经济发展、人口膨胀及环境污染等造成土壤干旱及土壤盐渍化现象日趋严重［1］，干旱、高盐及高温等非生物胁迫会严重影响植物的生长和发育，降低农作物产量［2］。新疆属于典型的干旱半干旱区，地形和气候复杂，也是中国沙漠化面积最大的区域［3］，生态环境脆弱，沙漠化问题严重影响着农业生产和人们的生产生活［4］。新疆特色沙漠固沙先锋植物羽毛针禾（Stipagrostis pennata）的根具有沙套结构，沙套对根系具有保水等作用，进而能够很好地适应沙漠的高温、干旱等非生物胁迫环境［5］。

在逆境胁迫条件下，植物的一些关键基因、蛋白、糖类、抗氧化酶类和次生代谢物酶类在胁迫响应中发挥着重要作用［6］。可溶性糖可作为渗透调节物质或者信号分子，提高植物在抗逆方面的作用［7］，其含量与植物抗逆能力正相关，它的积累可提高细胞渗透浓度、降低水势，从而增强细胞的保水能力［8］。非生物胁迫会影响细胞的稳定性，不同种类的糖可以直接作用在膜脂，还可以清除活性氧、保护细胞膜、降低细胞膜通透性［9］，从而维持植物在胁迫条件下的正常生长。植物沙套的形成与多糖组分的黏液有关［10］。Moore等［11］认为植物干旱响应可能与植物细胞壁中阿拉伯糖含量有关，富含阿拉伯糖的细胞壁更容易适应干旱环境。在干旱环境中，植物细胞壁发挥降低蒸腾作用、防止水分散失、调节细胞渗透压等作用。阿拉伯胶被认为是“增塑剂”，有助于保持植物细胞壁的柔韧性［12］。单糖L‐阿拉伯糖是植物细胞壁中各种结构多糖元素和糖蛋白的组成部分，阿拉伯糖-阿拉伯糖和阿拉伯糖-纤维素相互作用的合力可能是细胞壁完整性的一个促成因素［13］。阿拉伯呋喃糖苷酶（Alpha-L-Arabinofuranosidase ARAF）能够将未经还原的阿拉呋喃残基催化水解为果胶、半纤维素的同源阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳糖、阿拉伯木聚糖等［14］。ARAF可以催化提高从富含多糖的细胞壁基质中释放L-阿拉伯糖［15］。在非生物胁迫下，ARAF表达量上调，从而提高细胞壁转化效率，促进糖的生成，从而维持植物在非生物胁迫下的生长。

ARAF在植物应对逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用，但相关的机制研究少有报道。目前对于羽毛针禾的研究主要在种群特性、生态适应性及根部微生物等方面［16］，羽毛针禾的固沙作用可以有效地提高沙丘的稳定性，帮助更多的植物定居，增加植物多样性［17］。在沙漠极端环境中羽毛针禾进化出多种适应沙漠环境的机制［18］，根系和沙套结构的发达可提高水分吸收效率从而维持植物生长所需要的水分及微量元素［19］。羽毛针禾具有抗旱能力强、耐高低温等优良性状，是极端环境中一种极好的抗旱基因的资源。沙套在植物对非生物胁迫的耐受性中起着关键作用，受到干旱胁迫的禾本科植物的沙套更厚、更稳定，可提高水分吸收效率［20-21］。但从植物自身发育的角度解析沙套发育机制的相关研究较少。在前期工作基础上，本研究对SpARAF1的全长开放读码框序列进行克隆，并对其组织特异性表达和响应非生物胁迫的表达特征进行分析，为进一步解析SpARAF1在羽毛针禾沙套发育的功能及适应极端环境的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究的材料来源为新疆维吾尔自治区石河子市莫索湾水库附近沙漠套袋收集羽毛针禾成熟种子，种子消毒后将其种植在1/2MS培养基上生根发芽，15 d左右转移到MS培养基上得到完整植株作为试验材料（图1）。

图1

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图1   沙漠环境生长的羽毛针禾

Fig.1   Stipagrostis pennata plants growing in wild desert environment


RNA提取试剂盒、cDNA第一链反转录试剂盒、2×Taq PCR Master MixII、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取微量试剂盒都购自TIANGEN公司；pMD-19 T克隆载体、Real time PCR试剂购自TaKaRa生物公司；T4-DNA Ligase等相关试剂购自大连宝生物公司；Kpn I、BamH Ⅰ等相关酶购自TaKaRa生物公司；卡那霉素、庆大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl2及培养基配制等化学试剂均为国产分析纯，购自上海生工生物工程公司；农杆菌菌株GV 3101和亚细胞定位载体pCAMBIA 1300为新疆石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室保存，大肠杆菌感受态菌株DH 5α购自北京全式金生物公司；PCR引物的合成与DNA测序由新疆有康生物科技有限公司与上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2　方法

1.2.1　羽毛针禾的培育以及处理

挑选生长状态一致且饱满的羽毛针禾种子去壳消毒后播种于琼脂培养基中使其生根发芽，再转移到培养瓶使其长出侧根；通过前期预实验选用500 mmol·L-1甘露醇、250 mmol·L-1氯化钠和50 ℃下分别进行干旱、盐和高温处理0、3、6、12、24 h后收集根部备用。

1.2.2　羽毛针禾RNA提取及反转录

参照RNA提取试剂盒的说明书提取各个处理不同时间点羽毛针禾根部材料的总RNA，通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并结合分光光度计测定各样品的RNA浓度；以RNA为模板参考RNA反转录试剂盒说明书合成cDNA，-20 ℃下保存。

1.2.3　 SpARAF1 基因的克隆

从实验室前期羽毛针禾转录组数据库下载CDS序列，利用Primer Premier 5.0根据基因的保守序列设计引物SpARAF1-F和SpARAF1-R以及含有Kpn I和BamHI酶切位点的引物SpARAF1-EF和SpARAF1-ER（表1），以无菌培养的整株羽毛针禾的cDNA为模板，利用2×Taq PCR Master Mix扩增基因的全长序列。反应总体系为20 μL：cDNA（200 ng·μL-1）1 μL、引物SpARAF1-EF 1 μL、SpARAF1-ER 1 μL、2×Taq PCR Master Mix 10 μL、ddH20 7 μL。扩增程序：95 ℃下预变性3 min，95 ℃下变性30 s，47.7 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min 30 s，35个循环，72 ℃下延伸5 min，扩增后用1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测，参照DNA纯化胶回收试剂盒回收正确条带。送公司进行测序鉴定。

表1   本研究中使用的引物序列

Table 1  Primers used in this study

引物名称引物序列(5' to 3')引物 功能
SpARAF1-FATGGAAGTACTTTGTGAAACC基因 克隆
SpARAF1-RCCTGCGGTCATTGTCAT
SpARAF1-EFGGGGTACCATGGAAGTACTTTGTGAAACC
SpARAF1-ERCGGGATCCCCTGCGGTCATTGTCAT
q-ELF-FACTACCATCCCTATGAGCCAACT基因 表达 分析
q-ELF-RATCACTGCCAGCCTGAAGACA
q-GAPDH-FAGTCCGTCGCCATCGTCA
q-GAPDH-RCGTGCCCATGCCTTCTGT
q-APR6-FTCAATTCCAAGAAATGGCTCG
q-APR6-RTGGGTTCCACCAGTAACAAGG
q-SpARAF1-FATCTACAATCCTGGTTACTGGTCG
q-SpARAF1-RCTTGTCAGCCGTGATGGTGT

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1.2.4　基因的序列分析

应用NCBI 的在线ORF finder工具对SpARAF1基因进行蛋白翻译后，推导氨基酸序列。运用ExPSAy在线服务器中的ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam）软件分析SpARAF1编码蛋白质的理化性质；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. plpage=npsa_sopma.html）在线软件分析预测蛋白质二级结构；使用SWISS-MODEL（https：// swissmodel.expasy.org/interactive）在线预测蛋白质三级结构；应用ProtScale （http：//web.expasy.org/prots-cale/）对该蛋白的亲水性进行预测分析［22］；利用TMHMM Server 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）进行蛋白质序列跨膜结构域分析；使用Signal P 5.0 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析蛋白信号肽［23］；PSORT （http：//psort.hgc.jp/）预测蛋白质亚细胞定位；运用TBtools进行进化及保守域分析，通过MEGA 7.0构建Neighbor-joining系统进化树［24］。

1.2.5　植物表达载体的构建

运用DNAMAN软件进行序列比对分析，比对正确后，将其与pMD 19-T连接载体，转入DH 5α感受态细胞中，涂布在含氨苄的LB固体培养基上，12 h后挑选阳性单菌落进行验证后送上海生工生物工程股份有限公司进行检测，测序结果通过DNAMAN进行序列比对分析，比对正确的单菌落进行扩培后参考质粒提取试剂盒说明书提取质粒，得到SpARAF1基因的阳性质粒溶液。将包含35S启动子的pCAMBIA 1300-GFP载体和鉴定正确的pMD 19 T-SpARAF1阳性质粒同时用Kpn I和BamH I进行双酶切，通过胶回收纯化的线性SpARAF1基因和线性载体，用T4-DNA连接酶连接正确的线性目的基因和载体，得到重组质粒后转化DH 5α大肠感受态，将其涂布在含有氨苄抗性的LB固体培养基上，37 ℃下培养箱中培养12 h，挑选出单菌落进行菌落PCR验证后，送上海生工生物工程股份有限公司进行检测，选择测序正确的35 S：：SpARAF1-GFP重组质粒通过冻融法转化农杆菌GV 3101，在含有三抗（Gen 50 μg·mL-1、Kan 50 μg·mL-1、Rif 50 μg·mL-1）的LB固体培养基上涂布，28 ℃下培养36 h，挑选单菌落进行菌落PCR验证，将验证正确的菌液进行保存。

1.2.6　亚细胞定位

购买新鲜洋葱，将根部浸泡在水中，待根部伸长后将其除去外部3层鳞片，在超净工作台内用75%的酒精浸泡10 min，再用无菌水清洗3次。将其切开取内部较厚的鳞片，选取内表皮将其划出1 cm2左右的小方块，贴近叶肉的一面平铺在MS培养基上，避光培养2 d。活化重组质粒根癌农杆菌在含有庆大霉素、利福平和硫酸卡那霉素的液体LB培养基中活化，转速100×g、28 ℃下的摇床保持12 h；3 000×g、10 min离心，收集菌体沉淀；将预培养的洋葱放置在MS液体培养基重悬菌液（100 mmol·L-1 MES、10 mmol·L-1 MgCl2、100 μmol·L-1 AS），重悬菌体OD600值为0.8，在100×g 28 ℃摇床上震荡培养30 min，用滤纸吸菌液，正面朝上平铺放置在含有滤纸的MS固体培养基上，避光暗培养3 d后，观测前用ddH2O冲洗去残留附着在表面的农杆菌，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.2.7　基因表达分析

选择处理后的羽毛针禾根为材料，提取总RNA及反转录cDNA，以羽毛针禾GAPDH、ELF、APR6作为内参基因。利用软件Premier 5.0设计SpARAF1引物（表1），引用内参基因GAPDH、ELF、APR6［15］，参考SuperReal荧光定量预混试剂（SYBR Green）说明书，采用罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪扩增，体系10 μL：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，cDNA模板2.5 μL、RNase-free ddH2O 2.1 μL，扩增程序：95 ℃下预变性15 min，95 ℃下变性10 s，52 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸20 s，循环40次，每个样3个重复，根据2-ΔΔCt方法［25］计算目的基因的相对表达量。

1.2.8　SpARAF1蛋白质相互作用网络构建

将上述得到的羽毛针禾SpARAF1蛋白序列利用STRING数据库（https：//string-db.org/）预测与SpARAF1存在潜在互作关系的蛋白质以及预测与其存在潜在互作关系的蛋白质及所有相关蛋白的GO和KEGG注释分析。

2 结果与分析

2.1　全长基因的克隆及序列

以无菌培养的羽毛针禾整株材料的cDNA为模板，通过PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将符合预期长度的凝胶条带回收纯化后连接PMD-19 T载体后转化大肠杆菌DH 5α，挑选阳性菌落测序，测序确认后将其命名为SpARAF1，全长1 173 bp，编码391个氨基酸。预测分析结果显示，SpARAF1蛋白的总原子数5 961，其分子式为C1922H2913N513O595S18，该基因编码391个氨基酸，含量最高的氨基酸为丝氨酸（Ser）40个，含量最低的氨基酸为半胱氨酸（Cys）6个，分子质量43.3；该蛋白等电点为4.97，蛋白的不稳定指数43.36，说明SpARAF1蛋白是不稳定的蛋白。蛋白质折叠的主要驱动包括氨基酸的亲水性，SpARAF1蛋白为亲水性蛋白质。SpARAF1蛋白以a-螺旋、β折叠和无规卷曲二级结构基本均匀分布，其中α-螺旋有100个，β-折叠有36个，分别占总元件的25.58%和9.21%。三维结构预测结果与二级结构预测结果一致。蛋白的342~386位为保守结构域。SpARAF1蛋白质存在信号肽的概率为0.626%。该蛋白含有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸位点，存在个数分别为22、9、6个（图2）。推测ARAF1蛋白通过苏氨酸的磷酸化修饰调控蛋白质活性，从而在细胞信号转导的过程中起重要作用。蛋白主要定位于细胞壁，说明该基因在细胞壁中发挥作用。SpARAF1基因编码的蛋白质不存在跨膜结构域。

图2

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图2   SpARAF1基因的生物信息学分析

Fig.2   Bioinformatic analysis of SpARAF1


2.2　不同近缘物种的ARAF序列比对和保守结构域分析以及进化树的构建

羽毛针禾SpARAF1与糜子（Panicum miliaceum）、升马糖（Digitaria exilis）、柳枝稷（Panicum virgatum）、南荻（Miscanthus lutarioriparius）、狗尾巴草（Setaria viridis）、谷子（Setaria italica）、玉米（Zea maize）、水稻（Oryza sativa）和小麦（Triticum aestivum）ARAF的同源性分析显示，相似性分别为90.79%、89.77%、90.285%、90.54%、89.77%、89.77%、87.47%、90.28%和90.54%。多序列比对分析的不同物种都含有保守结构域Alpha-L-AF-C（图3），可能包括一个信号肽（Nielsen H）。SpARAF1与ZmARAF2和OsARAF1亲缘关系最近（图4）。

图3

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图3   SpARAF保守结构域分析

注：糜子：PmARAF1： RLN42654.1； 升马糖：DeARAF1： KAF8683943.1； 柳枝稷：PvARAF1： XP_039786342.1； 柳枝稷：PvARAF2： KAG2541198.1； 柳枝稷：PvARAF3 ：KAG2552340.1； 柳枝稷：PvARAF4： KAG2552343.1； 柳枝稷：PvARAF5： KAG2552342.1； 柳枝稷：PhARAF1： XP_025793326.1； 柳枝稷：DeARAF2： KAF8731184.1； 糜子：PmARAF2： RLN17277.1； 南荻：MiARAF1： CAD6203412.1； 谷子：SvARAF1： XP_034573888.1；南荻：MiARAF2：CAD6210968.1； SiARAF1 ：XP_012698307.1； 谷子：SiARAF2： XP_004984560.1； 谷子：SvARAF2： XP_034573886.1； 南荻：MiARAF3： CAD6203393.1； 玉米：ZmARAF1： Zm00001eb015240_P004； 水稻：OsARAF1： OGLUM11G01700.1.第一条黑色横线：ARAF信号肽Nielsen H；第二条黑色横线：ARAF保守结构域Alpha-L-AF-C

Fig.3   Conservative motif analysis of SpARAF


图4

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图4   羽毛针禾SpARAF1的系统进化树分析

Fig.4   Phylogenetic tree analysis of SpARAF1 from Stipagrostis pennata


进一步选择羽毛针禾SpARAF1和其他27个同科植物相似性较高的ARAF氨基酸序列比较分析（图5），结果显示，SpARAF1含有Alpha-L-AF-C和AbfA结构域超家族。除了OsARAF2含有2个保守的motif之外，其余所有的基因都含有3个motif。这些结果进一步表明了ARAF的高保守性。

图5

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图5   ARAF家族结构域与motif分析

Fig.5   Domain and motif analysis of ARAF


2.3　亚细胞定位

将SpARAF1基因与pCAMBIA1300-GFP载体用Kpn I和BamH I双酶切后用T4 DNA连接酶成功构建35S：：SpARAF1-GFP载体。将重组质粒转化洋葱，通过激光共聚焦显微镜定位观测亚细胞，结果显示SpARAF1在洋葱表皮细胞的细胞壁表达（图6）。

图6

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图6   质壁分离条件下SpARAF1的亚细胞定位分析

Fig.6   Subcellular localization analysis of SpARAF1


2.4　基因表达

为探究SpARAF1在羽毛针禾中的表达特征，利用RT-qPCR分析SpARAF1在羽毛针禾不同组织及干旱、盐、高温处理下的表达水平。在盐和干旱胁迫处理下，随着处理时间的增加，SpARAF1基因的表达量显著受到诱导表达（图7）。在高温胁迫处理下，SpARAF1基因的表达随时间的延长显著升高，表明了SpARAF1基因在非生物胁迫响应过程中的重要作用。组织特异性分析显示SpARAF1基因在根中表达量最高，表明了SpARAF1基因在这些组织发育中的重要作用。

图7

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图7   SpARAF1的表达特征分析

注：不同小写字母表示不同时间点之间的基因表达量差异显著（P0.05）

Fig.7   Expression feature analysis of SpARAF1


2.5　SpARAF1相互作用蛋白质预测

利用STRING数据库 （https：//cn.string-db.org/）对羽毛针禾SpARAF1进行蛋白互作网络分析。与SpARAF1存在相互作用的蛋白质分别为8个碳水化合物激酶（carbohydrate kinase），1个谷胱甘肽脱氢酶 （glutathione dehydrogenase），7个聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，图8）。在KEGG （kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路中显著富集在代谢途径戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化（map01100）、糖酵解（map00040）、葡萄糖异生（map00010）、酪氨酸代谢（map00350）、脂肪酸降解（map00071）、氨基糖和核苷酸糖代谢（map00520）、甘油脂代谢（map00561）、次级代谢物的生物合成（map01110）、半乳糖代谢（map00052）、抗坏血酸和醛酸代谢（map00053）、碳代谢（map01200），这些互作蛋白在GO（gene ontology）注释中主要富集在小分子代谢过程（GO：0044282）、半乳糖代谢过程（GO：0005975）、单糖代谢过程（GO：0006012）、对有毒物质的响应有机物分解代谢过程（GO：0005996）、有机物分解代谢过程（GO：0071704）、多元醇分解代谢过程（GO：0046174）、细胞碳水化合物代谢过程（GO：0044262）、细胞分解代谢过程（GO：0044248），表明SpARAF1蛋白及其互作蛋白广泛参与糖代谢转化等过程发挥作用。

图8

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图8   SpARAF1蛋白质相互作用分析

Fig.8   Protein interaction prediction analysis of SpARAF1


3 讨论

植物在生长发育过程中常常面临许多非生物胁迫环境［26］。细胞壁作为细胞与外界环境的边界，能够感知非生物胁迫并将胁迫信号传递到质膜，引起细胞质中钙离子、活性氧信号和脱落酸等激素水平的变化以及相关蛋白磷酸化，以及通过转录和翻译水平调控细胞壁各组分合成酶基因表达来适应非生物胁迫［27］。糖在胁迫感知和信号传递中发挥着重要作用，是胁迫基因表达的调节中枢，确保渗透调节、清除ROS的反应，并通过碳分配维持细胞的能量状态［28］。糖转运蛋白通过调节碳水化合物的分配，参与和感知生物与非生物胁迫的关键信号传导［29］。植物的沙套结构对于沙漠极端环境适应具有重要作用［30］，我们前期发现羽毛针禾沙套的形成与糖密切相关［31］，克隆获得一个羽毛针禾糖转运蛋白基因SWEET，该基因的表达与非生物胁迫密切相关［25］。本研究获得一个编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因SpARAF1，该基因具有典型的Alpha-L-AF-C和AbfA结构域，可能在糖代谢过程中发挥重要作用。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶能够通过提高植物的抗氧化能力进而增强其抗旱性以及植物根系发育［32］。复活植物中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的表达水平高约占水解细胞壁组分的35%~40%，表明了ARAF在干旱响应过程中的重要作用［33］。基因的亚细胞定位可以揭示细胞内各种结构和分子的功能以及在细胞内的相互作用。拟南芥中两个编码ARAF的基因（AtASD_1和AtASD_2）定位于细胞壁，对多糖的分解与代谢起关键作用［16］。阿拉伯糖的聚合物是植物细胞壁的主要成分，富含阿拉伯糖的聚合物作为一种进化策略，可以塑化复活植物细胞壁以防止干燥。葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖（glucuronoarabinoxylan，GAX）、果胶阿拉伯糖（L-arabinose）和阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins， AGP）可以通过增强细胞壁的柔韧性来提高植物的干旱耐受性［34］，另外，SpARAF1在拟南芥细胞增殖区以及组织的衰老和脱落区表达［16］，同时参与未成熟萝卜种子中阿拉伯半乳聚糖蛋白的碳水化合物部分的水解，通过细胞壁的变化在果实成熟和软化过程中发挥重要作用［35］。本研究中，SpARAF1基因在根组织中表现出最显著的累积表达，表明该基因与根及根部沙套发育之间存在密切联系。同时，羽毛针禾SpARAF1基因编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，在干旱、盐、高温胁迫下受到显著的诱导表达，另外，羽毛针禾SpARAF1基因编码的蛋白质定位在细胞壁。这些结果都说明了该基因很有可能通过影响细胞壁的结构与组分变化来提高植物对应非生物胁迫的耐受性。关于植物α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的功能及调控机制鲜有报道［36］。大麦α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在谷物萌发过程中介导了阿拉伯木聚糖的代谢［37］，推测在细胞生长过程中通过改变细胞壁的阿拉伯木聚糖组分促进谷物的萌发［38］。番茄中存在3种a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶同工酶［39］，免疫分析显示这些同工酶与植物激素赤霉素和乙烯信号密切相关［40］。那么羽毛针禾SpARAF1蛋白是否参与了植物激素的信号调控，是否通过与植物激素之间的调控来提高植物对抗逆境的能力的？这些都值得进一步地研究。

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