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中国沙漠, 2025, 45(5): 217-229 doi: 10.7522/j.issn.1000-694X.2025.00119

毛乌素沙地生物结皮中化能自养型微生物的筛选鉴定及其固碳能力评估

赵广伟,1, 牛向雯5, 白存琳5, 孟延荣1, 张宇清1,3,4, 秦树高2, 佘维维2, 冯薇,2

1.北京林业大学,宁夏盐池毛乌素沙地生态系统国家定位观测研究站,北京 100083

2.北京林业大学,林木资源高效生产全国重点实验室,北京 100083

3.北京林业大学,林木育种与生态修复国家工程研究中心,北京 100083

4.北京林业大学,水土保持国家林业和草原局重点实验室,北京 100083

5.北京林业大学,林业生态工程教育部工程中心,北京 100083

6.宁夏哈巴湖国家级自然保护区管理局,宁夏 盐池 751500

Screening, identification and carbon fixation capacity assessment of chemolithoautotrophic microorganisms in biological soil crusts of Mu Us Sandy Land

Zhao Guangwei,1, Niu Xiangwen5, Bai Cunlin5, Meng Yanrong1, Zhang Yuqing1,3,4, Qin Shugao2, She Weiwei2, Feng Wei,2

1.Yanchi Research Station /, Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China

2.State Key Laboratory of Efficient Production of Forest Resource /, Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China

3.National Engineering Research Center for Tree Breeding and Ecological Restoration /, Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China

4.Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Soil and Water Conservation /, Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China

5.Engineering Research Center of Forestry Ecological Engineering, Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China

6.Administrative Bureau of Ningxia Haba Lake National Nature Reserve,Yanchi 751500,Ningxia,China

通讯作者: 冯薇(E-mail: weifeng@bjfu.edu.cn

收稿日期: 2025-02-11   修回日期: 2025-05-15  

基金资助: 盐池县重点研发计划项目.  2023YCYDCT001
2025年中央财政国家级自然保护区补助资金项目“哈巴湖国家级自然保护区综合科学考察和专项调查项目”
国家自然科学基金项目.  32572159

Received: 2025-02-11   Revised: 2025-05-15  

作者简介 About authors

赵广伟(1999—),男,山东临沂人,硕士研究生,主要从事荒漠生物土壤结皮研究E-mail:2505160288@qq.com , E-mail:2505160288@qq.com

摘要

为探究毛乌素沙地生物结皮中可培养化能自养型微生物的种类及其理化特性,并筛选出具有高效固碳能力及潜在应用价值的菌株资源,本研究采用无碳源无机培养基,通过分离纯化并连续传代9次,获得具有稳定遗传性状的固碳菌株。基于菌株的形态学特征、生长特性、生理生化特性和16S rDNA序列分析,对固碳菌株进行系统鉴定。通过测定菌液中关键固碳酶(ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RubisCO))活性、有机碳含量和固碳功能基因凝胶电泳,进一步解析菌株固碳途径及其固碳效率。结果表明:从生物结皮样品中共筛选出18株化能自养型菌株,分别隶属于链霉菌属(Streptomyces)10株、糖丝菌属(Saccharothrix)3株,以及红球菌属(Rhodococcus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、游动放线菌属(Actinoplanes)和不动杆菌属(Acinetobacter)各1株。其中,糖丝菌属和游动放线菌属细菌被首次验证具有固碳功能,同时发现同一菌株可通过多种途径实现固碳。在固碳能力方面,链霉菌属的3、5、14号菌株及甲基杆菌属的2号菌株均表现出较高的有机碳积累能力,其有机碳含量分别为57.82、58.21、62.89、65.94 mg·L-1,并伴随显著的水解活性,表明以上菌株在荒漠区土壤改良和生态修复中具有潜在微生物菌剂应用价值。本研究为荒漠生态系统的生物地球化学循环调控提供新型功能菌种资源。

关键词: 毛乌素沙地 ; 生物结皮 ; 固碳酶 ; 有机碳含量 ; 化能自养型菌株

Abstract

To explore the types and physicochemical characteristics of culturable chemoautotrophic microorganisms in the biological crusts of the Mu Us Sandy Land and to screen out strains with high carbon fixation capacity and potential application value, this study used an inorganic medium without carbon sources and obtained stable carbon-fixing strains through continuous separation and subculture for 9 generations. Based on morphological characteristics, growth characteristics, physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence analysis, the carbon-fixing strains were systematically identified. The carbon fixation pathways and carbon fixation efficiency of the strains were further analyzed by measuring the activities of key carbon fixation enzymes (ATP-citrate lyase (ACLY) and ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RubisCO)), organic carbon content, and gel electrophoresis of carbon fixation functional genes in the bacterial culture. The results showed that a total of 18 chemoautotrophic strains were screened from the biological crust samples, belonging to Streptomyces (10 strains), Saccharothrix (3 strains), RhodococcusMethylobacteriumArthrobacterActinoplanes, and Acinetobacter (1 strain each). Among them, the carbon fixation function of Saccharothrix and Actinoplanes bacteria was verified for the first time, and it was found that the same strain could achieve carbon fixation through multiple pathways. In terms of carbon fixation capacity, strains 3, 5, and 14 of Streptomyces and strain 2 of Methylobacterium showed high organic carbon accumulation capacity, with organic carbon contents of 57.82, 58.21, 62.89 mg·L-1, and 65.94 mg·L-1, respectively, and accompanied by significant hydrolytic activity, indicating that these strains have potential application value as microbial agents for soil improvement and ecological restoration in desert areas. This study not only expanded the cognitive boundary of microbial carbon sink function in arid areas but also provided new functional bacterial resources for the regulation of biogeochemical cycles in desert ecosystems.

Keywords: Mu Us Sandy Land ; biological crust ; carbon-fixing enzyme ; organic carbon content ; chemoautotrophic strains

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本文引用格式

赵广伟, 牛向雯, 白存琳, 孟延荣, 张宇清, 秦树高, 佘维维, 冯薇. 毛乌素沙地生物结皮中化能自养型微生物的筛选鉴定及其固碳能力评估. 中国沙漠[J], 2025, 45(5): 217-229 doi:10.7522/j.issn.1000-694X.2025.00119

Zhao Guangwei, Niu Xiangwen, Bai Cunlin, Meng Yanrong, Zhang Yuqing, Qin Shugao, She Weiwei, Feng Wei. Screening, identification and carbon fixation capacity assessment of chemolithoautotrophic microorganisms in biological soil crusts of Mu Us Sandy Land. Journal of Desert Research[J], 2025, 45(5): 217-229 doi:10.7522/j.issn.1000-694X.2025.00119

0 引言

土壤是陆地生态系统中最大、最活跃的碳库,其碳储量分别为植被和大气碳库储量的约3倍和2倍1,在缓解大气温室气体浓度升高方面具有显著潜力2。植物可通过光合作用将CO2转化为有机质,并以凋落物、根系分泌物等形式输入土壤,是土壤有机碳(SOC)的重要来源3。与此同时,除了植物外,土壤微生物也具有固定CO2的能力,虽固碳量低于植物,但微生物种类多、分布范围广,尤其在碳限制型生态系统中,微生物固碳对维持自身功能多样性以及生态系统碳循环过程具有重要意义4。与植物源碳相比,微生物固定的碳可被微生物直接同化,并在微生物死亡后以微生物残体碳(MNC)等更稳定的形式存储于土壤,有利于土壤碳固存和累积5。因此,系统解析土壤固碳微生物的类群组成、代谢特性及其固碳机制,不仅有助于完善陆地碳循环理论体系,也可以为开发基于微生物调控的碳汇增强技术提供科学依据。

荒漠生态系统因其干旱胁迫与养分匮乏的生境条件,限制了植物源有机碳输入,导致荒漠区SOC储量较低6。作为荒漠生态系统的重要组分,生物土壤结皮(简称生物结皮,BSCs)能够有效增加表层SOC含量7。BSCs是由藻类、苔藓、固碳微生物等自养生物和细菌、真菌等异养生物,通过菌丝体、假根和多聚糖等分泌物与土壤表层颗粒胶结形成的复合体,依据物种组成可分为藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮8。BSCs常在灌草群落下方及植被间空地广泛发育,其盖度在荒漠区为40%~70%,约占陆地面积的12%9-10。研究发现,除藻类和苔藓外,BSCs中还存在丰富的光能自养型和化能自养型固碳微生物类群,并具有可观的固碳潜能。然而,不同BSCs类型的优势固碳微生物具有显著差异,藻结皮中的优势类群是蓝藻门(Cyanobacteria)、绿藻门(Chlorophyta)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonas)和红螺菌目(Rhodospirillales),地衣结皮中的优势类群是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门和酸杆菌门(Acidobacteria),苔藓结皮中的优势类群是变形菌门和硅藻门(Bacillariophyta)11-13。以上自养型微生物通过卡尔文循环(CBB)、还原性三羧酸循环(rTCA)等固碳途径实现碳同化,其固碳产物可通过微生物残体稳定化途径形成持久性土壤碳库5,从而突破传统荒漠生态系统碳汇形成的植物依赖性限制。

近年来,荒漠区固碳微生物的研究与应用主要在光合固碳领域,尤以藻结皮中蓝藻类群为典型代表。相关研究表明,蓝藻类群在水分及营养条件适宜时,生物量积累速率是高等植物的50倍,可以更高效地固定CO214。基于此开展的试验显示,在伊朗马赞达拉省半干旱区进行蓝藻接种后,试验区可增加3.11~3.93 t·a-1·hm-2 CO2,约是对照组的2.8倍15。在古尔班通古特和腾格里沙漠,蓝藻的接种还会对藻类生物量、结皮厚度、土壤酶活性和生物多样性恢复有促进作用16-17。尽管如此,受限于光照、水分和营养特殊性,蓝藻也具有一定的局限性。其一,在BSCs形成初期阶段,流沙易于覆盖藻结皮表面导致光能捕获率降低40%~65%,从而阻碍蓝藻进行光合作用以固定碳元素18。其二,水分对于BSCs的形成和发育起着至关重要的作用,当表层土壤含水量低于3.5%时,可完全抑制其光能自养活性,蓝藻生物量呈指数级衰减,甚至死亡19。其三,蓝藻定殖过程对土壤基质条件有着较高依赖性,初期土壤中的有机质、全氮及全磷含量低,不利于蓝藻的定殖和存活20。相比之下,化能自养微生物的寡营养适应机制(C∶N∶P需求比为100∶3∶0.3)与耐脱水特性(存活含水量阈值>1.5%)使其更有利于在荒漠生境中存活21。研究显示,在BSCs形成之前,化能自养微生物可作为先锋物种通过分泌胞外聚合物(EPS)促进土壤团聚体形成,使表层微环境持水能力提升15%~20%,同时输入2.8~4.6 g·m-2·a-1初始有机碳(C),为后续蓝藻定殖创造必要的微环境22。然而,目前对荒漠区化能自养微生物分离筛选及应用的研究十分有限,严重制约微生物资源在干旱区碳增汇技术中的应用转化。

毛乌素沙地地处半干旱荒漠区,生态环境脆弱、资源匮乏,得益于近几十年来防沙治沙工程的开展,该区域BSCs总体平均盖度已达30%,BSCs层及其下伏土层0~5 cm的总碳储量显著高于裸沙地,拥有丰富的固碳微生物资源23-24。基于此,本文以毛乌素沙地BSCs为研究对象,采用无碳源无机培养基筛选固碳菌株,对菌株固碳酶活性和有机碳含量进行测定,利用功能基因进行验证,明确菌株固碳途径和能力,筛选出固碳能力强具有应用价值的化能自养型菌株,以期通过人工调控开发基于菌群互作的快速形成BSCs的新技术,为实现荒漠生态系统碳汇功能提升和退化土壤生物修复提供理论支撑与微生物资源。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究在宁夏盐池毛乌素沙地生态系统国家定位观测研究站(37°04′—38°10′N、106°30′—107°41′E,海拔1 530 m)进行,站区位于毛乌素沙地的西南边缘。研究区是干旱区与半干旱区的过渡地带,属于典型中温带大陆性季风气候,多年平均气温和降水量分别为8.1 ℃和292 mm25。土壤类型以风沙土为主,其次是黑垆土与灰钙土,土壤结构松散,肥力较低,易受侵蚀26-27。植被以沙生、旱生植物为主,主要包括黑沙蒿(Artemisia ordosica)、北沙柳(Salix psammophila)、赖草(Leymus secalinus)和阿尔泰狗娃花(Aster altaicus)等28。BSCs是研究区常见的地被物,总体盖度大于30%,主要类型包括藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮,对应的优势种分别为具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatus)、坚韧胶衣(Collema tenax)和银叶真藓(Bryum argenteum),其中藻结皮和地衣结皮多在灌丛间发育,而苔藓结皮多分布于灌丛下29

1.2 样品采集

本实验样品采集于2023年7月宁夏盐池毛乌素沙地生态系统国家定位观测研究站(位于宁夏哈巴湖国家级自然保护区内)。研究区植被与BSCs镶嵌分布,植被间空地BSCs覆盖度可达80%。为尽可能地分离出更多种类的固碳菌株,选择藻结皮、地衣结皮、苔藓结皮分布区域,在每种类型BSCs覆盖区按照“S”型分别设置10个1 m×1 m样方,每个样方间隔50 m以上。在每个样方内,采用“五点取样法”取结皮层土样,将同一样方中5个样点的结皮层土样混合作为1个样品,共计30个样品。取样前对取样器材进行消毒,取样后样品于4 ℃保存迅速带回实验室,过2 mm筛处理后立即进行后续分离实验。

1.3 供试培养基

无碳源无机培养基(g·L-1):MnSO4 1 g,Na2HPO4 0.5 g,KH2PO4 0.5 g,MgSO4 1 g,CaCl2 0.2 g,NaHCO3 1 g,NH4Cl 0.5 g,KNO3 1 g,NaCl 0.4 g,微量元素溶液2 mL。微量元素溶液的配制为:FeCl3 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.3 g,MnSO4·H2O 0.15 g,ZnSO4 0.14 g,CoCl2 0.2 g,微量元素过0.22 μm滤膜除菌30。pH值7.5,琼脂20 g(液体培养基不加),121 ℃灭菌20 min,用于固碳菌株的筛选、菌液固碳酶活性和相关碳含量测定。

Luria-Bertani(LB)培养基(g·L-1):酵母提取物5 g,NaCl 10 g,胰蛋白胨10 g,pH值7.2~7.4,琼脂20 g(液体培养基不加),121 ℃灭菌15 min,用于菌株保藏和生长情况测定31

营养培养基(g·L-1):蛋白胨10 g,NaCl 5 g,牛肉膏粉3 g,pH值7.1~7.5,琼脂20 g(液体培养基不加),121 ℃灭菌15 min,用于菌株淀粉和尿素水解能力测定32

羧甲基纤维素钠培养基(g·L-1):羧甲基纤维素钠10 g,Na2HPO4 2.5 g,KH2PO4 1.5 g,蛋白胨2.5 g,酵母膏0.5 g,pH值7.0~7.4,琼脂20 g(液体培养基不加),121 ℃灭菌25 min,用于菌株纤维素水解能力测定33

明胶培养基(g·L-1):蛋白胨5 g,明胶120 g,pH值7.2~7.4,琼脂20 g(液体培养基不加),115 ℃灭菌20 min,用于菌株明胶水解能力测定32

1.4 固碳菌株筛选及鉴定

1.4.1 固碳菌株的分离纯化及形态观察

称取10 g样品加入装有90 mL无菌水的三角瓶中,同时加入少许灭菌玻璃珠,置于30 ℃,150 r·min-1摇床振荡约20 min,制成悬液,进行梯度稀释。在无菌操作下,稀释原浓度至1/1 000,吸取100 μL样品悬液,涂布于无碳源无机固体培养基中,同时设置等量无菌水作为对照,每组3个重复。将涂布后的平板放入30 ℃黑暗培养箱中进行倒置培养5~8 d,根据平板中菌落形态不同,挑取不同单菌落分别于新的无碳源无机培养基中进行划线纯化。重复上述操作,直至平板中目测为纯菌,并对幼龄单菌落进行形态观察。

1.4.2 固碳菌株传代培养及自养类型验证

为了获得适应性强、具有稳定遗传特性和不易发生变异的菌株,将上述纯化后的菌株在无碳源无机固体培养基中进行传代培养,舍弃在传代中生长趋势明显减弱的菌株,且在最后3代培养时将黑暗条件改为光照,观察光照条件对菌株生长是否有影响,初步确定自养类型。本实验总共传代9次,获得第10代目的菌株。

1.4.3 固碳菌株16S rDNA测序及鉴定

按照离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)的提取步骤,提取不同菌株的基因组DNA。以提取细菌组总DNA为模板,进行PCR反应扩增,通用引物上下游序列分别为27 F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492 R:5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’,PCR体系及反应循环按照试剂盒(生工)进行设置34。PCR产物经1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测后送至公司(睿博兴科)测序,测序结果在NCBI库中进行BlAST比对,并绘制系统发育树。

1.5 固碳菌株生长情况及生理生化特性测定
1.5.1 固碳菌株OD600 测定

使用一次性接种环,每菌株取一环的量,将筛选后的菌株分别接种于20 mL LB液体培养基中进行摇床培养,同时设置空白对照,每组3个重复。摇床条件设置为30 ℃、150 r·min-1、黑暗,每隔2 h使用酶标仪对菌液浓度进行测定,直至菌株到达生长末期,并绘制生长曲线35

1.5.2 固碳菌株干重测定

将在LB液体培养基中处于稳定期时的菌液离心去上清液,无菌水洗涤2次,洗去残余培养基后,用封口膜密封,置于烘箱中烘干,随后测定菌体干重36

1.5.3 固碳菌株淀粉、纤维素、尿素和明胶水解能力测定

具体培养基配置方法参照相关文献[32]。取处于对数生长期的菌液10 μL,点植于相关功能性培养基中,明胶水解则用穿刺法接种,同时以未接菌为对照,每组4个重复。淀粉和纤维素培养基培养4 d后滴加相关试剂,根据水解圈RD/dD为透明圈直径,d为菌落直径)的大小判定水解能力,而尿素和明胶水解能力则是根据出现变红和液化现象时间长短判定。

1.6 菌液固碳酶活性测定及固碳功能基因验证
1.6.1 菌液ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RubisCO)活性测定

将目的菌株接种于无碳源无机液体培养基中进行摇床培养,摇床条件设置与上述相同,同时设置培养基空白对照,每组3个重复。为避免培养时间过长对酶活性产生影响,根据菌液颜色变化(指示稳定期)终止培养,本实验共持续20 d。培养结束后,取100 μL对照组溶液,涂布于LB培养基中进行培养,确保摇床培养过程期间没有染菌,随后相关菌液酶活性通过试剂盒(生工)进行测定。

1.6.2 固碳功能基因验证

根据固碳酶活性测定结果,选取酶活性低的菌株,每种酶各取2株,进行固碳功能基因的验证。ACLY酶对应的固碳功能基因为oorA,引物序列为oorA67 F:5’-TTCTTCGCTGGGTAYCCNATHAC-NCC-3’和oorB68 R:5’-CCRCANCCCCARCACCA-3’,退火温度52 ℃,预计片段长度1 000 bp;RubisCO酶对应的固碳功能基因为cbbl,引物序列为168 F:5’-CGGCACSTGGACCACSGTSTGGAC-3’和786 R:5’-GTARTCGTGCATGATGATSGG-3’,退火温度60 ℃,预计片段长度618 bp。PCR体系及反应循环按照试剂盒(生工)进行设置,PCR产物经1%琼脂糖核酸凝胶电泳22 min后,放进凝胶成像仪中进行目的条带观察。

1.7 菌液碳含量测定

将在无碳源无机液体培养基中培养20 d后的菌液过0.45 μm滤膜,用无菌去离子水进行稀释后,将样品置于总有机碳分析仪(Shimadzu TOC-LCPH型)中,测得菌液的总碳(TC)和总无机碳(TIC)含量,随后通过差减法计算菌液的总有机碳(TOC)含量。

1.8 数据处理与分析

采用SPSS Statistics 17.0软件进行数据分析。对相关指标(菌液干重、固碳酶活性和TOC)采用Shapiro-wilk和Bartlett法进行方差齐性与正态检验,通过检验的指标采用单因素方差分析,采用Tukey法进行多重比较。采用MEGA 11处理菌株16S rDNA序列,并绘制系统发育树,Origin 9.1作图。

2 结果与分析

2.1 固碳菌株的鉴定及形态学特征

从藻、地衣和苔藓结皮样品中共筛选出18株固碳菌株,由系统发育树(图1)可知,固碳菌株分别隶属于2门7属。其中,放线菌门的链霉菌属(Streptomyces)分离率最高,为55.56%(10株);放线菌门的糖丝菌属(Saccharothrix)分离率次之,为16.67%(3株);最低的是放线菌门的红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、游动放线菌属(Actinoplanes)和变形菌门的甲基杆菌属(Methylobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter),都为5.6%(各1株)。在无碳源无机培养基中,固碳菌株的菌落颜色以白色、黄色和粉红色为主,形状以圆形居多,链霉菌属的菌株带有粉状孢子(图2)。在光照与黑暗条件下,18株固碳菌株的生长速率及形态特征均未表现出显著差异,初步判定为化能自养型菌株。除16号菌株外,其余菌株在LB培养基中的生长速率均显著高于在无碳源无机培养基中,可知16号菌株可能属于严格化能自养型菌株,而其余菌株均属于兼性化能自养型菌株,具体鉴定结果如表1所列。

图1

图1   固碳菌株系统发育树的构建

注:同一颜色为相同属,节点处数字为置信度

Fig.1   Construction of carbon-fixingstrains phylogenetic tree


图2

图2   固碳菌株在无碳源无机培养基中的形态特征

Fig.2   Morphological characteristics of carbon-fixing strains in inorganic medium without carbon sources


表1   化能自养型菌株鉴定结果

Table 1  Identification results of chemoautotrophic strains

编号拉丁名种名相似度/%属名门名菌落特征
1Rhodococcus fascians筋膜红球菌100红球菌属放线菌门黄色、圆形、表面光滑、凸面边缘整齐
2Methylobacterium aminovorans氨基沃兰甲基杆菌99.78甲基杆菌属变形菌门红色、圆形、表面光滑、单菌落小
3Streptomyces phaeoluteigriseus黄链霉菌99.65链霉菌属放线菌门淡黄色、圆形、扩展、无明显粉状孢子
4Streptomyces venezuelae委内瑞拉链霉菌99.79链霉菌属放线菌门白色、圆形、中凹台状、粉状孢子
5Streptomyces flavogriseus黄灰链霉菌100链霉菌属放线菌门黄色、卷发状、粗糙、中凹台状
6Streptomyces anulatus无核链霉菌100链霉菌属放线菌门淡黄色、同心环状、粗糙、粉状孢子
7Arthrobacter nitroguajacolicus硝基瓜菌关节杆菌99.93节杆菌属放线菌门淡黄色、凸面、黏稠、表面光滑
8Saccharothrix texasensis德克萨斯糖丝菌99.78糖丝菌属放线菌门白色、卷发状、中凹台状、粗糙
9Saccharothrix espanaensis西班牙糖丝菌99.49糖丝菌属放线菌门白色、覆轮状、粗糙、边缘整齐
10Streptomyces lavendofoliae薰衣草链霉菌100链霉菌属放线菌门白色、圆形、菌丝体状、粉状孢子
11Streptomyces phaeochromogenes显色链霉菌100链霉菌属放线菌门粉红色、圆形、同心环 、粉状孢子
12Streptomyces gulbargensis古尔巴根链霉菌100链霉菌属放线菌门粉红色、椭圆形、同心环 、粉状孢子
13Actinoplanes teichomyceticus泰式放线菌98.54游动放线菌属放线菌门橙黄色、不规则状、较硬、无明显粉状孢子
14Streptomyces griseiscabiei灰色链霉菌99.86链霉菌属放线菌门黄色、不规则状、粉状孢子
15Acinetobacter calcoaceticus醋酸钙不动杆菌100不动杆菌属变形菌门白色、黏稠湿润、圆形、凸面边缘整齐
16Saccharothrix ghardaiensis加纳糖丝酵母99.28糖丝菌属放线菌门白色、粗糙、不规则状、中凹台状
17Streptomyces zaomyceticus早霉素链霉菌100链霉菌属放线菌门粉红色、圆形、菌丝体状、粉状孢子
18Streptomyces viridochromogenes绿色产色链霉菌99.71链霉菌属放线菌门淡黄色、圆形、粉状孢子

注:种名的判定依据为NCBI库中相似度最高的菌株,≥98.7%为同一物种。

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2.2 固碳菌株的生长情况

根据菌株在LB液体培养基中到达稳定期时OD值的不同,将菌株划分为3类,OD>2为适宜生长型(6株,图3A),2>OD>1为较适宜生长型(6株,图3B),OD<1为不适宜生长型(6株,图3C)。根据菌株的生长曲线可知,多数菌株在培养10~20 h到达对数生长期,此时细胞的酶活性最高,取此阶段的培养液进行后续水解反应实验最为合适。对培养40 h后的菌液进行干重测量,结果如图3D,菌株3、4、6、7、12、14、17和18保持着较高的菌体干重,菌株8和16的干重则较低。综合来看,该实验条件下,适宜生长型菌株同时拥有着较高的菌体干重,具有分裂能力强、生长速率快等特点,是易于培养的优良菌株。同时,该实验结果也可为后期菌株扩繁培养及菌剂制备提供依据。

图3

图3   固碳菌株在LB液体培养基中的生长情况

Fig.3   Growth of carbon-fixing strains in LB liquid medium


2.3 固碳菌株的生理生化特性

18株固碳菌株的水解反应现象及能力如图4表2所示。在淀粉水解实验中,菌株3、4、5、6、7、9、10、11、13、14和16在培养基上出现阳性反应。其中,菌株4、5、6、9的淀粉水解能力最强,透明圈与菌落直径之比分别为5、5.6、3.64和3。在纤维素水解实验中,菌株3、4、5、6、9、10、11、12、14、17和18在培养基上出现阳性反应。其中,菌株3、5、6、9、11、12、17的纤维素水解能力最强,透明圈与菌落直径之比分别为4.33、3.22、4.2、3、3.38、3.67和3.27。在尿素水解实验中,菌株1、2、4、6、7、12、14和15在培养基上出现阳性反应。其中,菌株1、4、15的尿素水解能力最强,培养基由黄色变为红色所需时间分别为24、12 h和24 h。在明胶水解实验中,菌株4和6在试管中出现阳性反应,明胶由固体变为液体所需时间分别为10 d和5 d。根据以上结果可知,菌株4、6具有多种水解能力,而8号菌株在实验过程中未出现上述水解反应。

图4

图4   固碳菌株相应水解结果

Fig.4   The corresponding hydrolysis results of carbon-fixing strains


表2   固碳菌株的水解能力

Table 2  Hydrolysis capacity of carbon-fixing strains

编号淀粉水解纤维素水解尿素水解明胶水解
124 h
236 h
31.38±0.02ab4.33±0.17h
45.00±0.07h1.13±0.09a12 h10 d
55.60±0.12i3.22±0.04f
63.64±0.04g4.20±0.10h48 h5 d
71.76±0.07d36 h
8
93.00±0.11f3.00±0.05e
101.50±0.05bc2.33±0.08c
112.31±0.06e3.38±0.11f
123.67±0.13g48 h
131.36±0.03a
142.19±0.10e1.60±0.02b36 h
1524 h
161.57±0.04c
173.27±0.07f
182.63±0.14d

注:“—”表示在实验期内没有出现相应水解能力,尿素水解实验期为72 h,明胶水解实验期为15 d。

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2.4 固碳菌株的固碳酶活性及功能基因验证

根据固碳酶活性的测定结果可知,除2号菌株外,其余菌株的ACLY酶活性和RubisCO酶活性均显著增加(图5A、B)。菌株5、6、7、9、10、12、16和17的ACLY酶活性最高,而菌株3、4、11、15、16和18的RubisCO酶活性最高。同一菌株的两种酶活性呈现出“此消彼长”的现象,这可能是由于不同菌株主导的固碳途径不同所导致。对每种酶活性最低的2菌株进行固碳功能基因验证,结果显示(图5C),与CK相比,ACLY酶活性最低的菌株2和菌株18在1 000 bp附近出现条带,RubisCO酶活性最低的菌株10和菌株13在618 bp附近出现条带,4菌株经验证均具有相应的固碳功能基因。由此推出,酶活性更高的其他菌株也同样具有相应的固碳功能基因。

图5

图5   固碳菌株固碳酶活性及功能基因验证图

Fig.5   Carbon sequestration enzyme activity and functional gene verification of carbon-fixing strains


2.5 固碳菌株菌液的TOC含量

对培养20 d后菌液的TOC含量进行测定(图6),与CK相比,菌液的TOC含量显著升高。其中,菌株2、3、5、14的TOC含量最高,分别为65.94、57.82、58.21、62.89 mg·L-1,具有较高的固碳能力。

图6

图6   固碳菌株菌液的相关碳含量

Fig.6   The relevant carbon content of the bacterial liquid of carbon-fixing strains


3 讨论

3.1 BSCs中可培养化能自养型菌株类群

研究结果表明,毛乌素沙地BSCs中含有较多可培养的化能自养型菌株(表1)。筛选出的18株固碳菌中,优势菌群为放线菌门的链霉菌属(占比55.56%),其次为放线菌门的糖丝菌属(占比16.67%),其他还包括少量红球菌属、节杆菌属、游动放线菌属以及变形菌门的甲基杆菌属和不动杆菌属。该研究结果与毛乌素沙地和古尔班通古特沙漠BSCs中利用高通量测序解析的潜在固碳微生物类群结果相似1337-38。高通量测序技术可快速明晰土壤中潜在的固碳菌类群,但该结果并不能够直接反映菌株功能基因是否表达及其可培养性。本研究利用无碳源无机培养基分离筛选固碳菌株,并进一步解析其固碳途径和能力,为固碳菌株的实践应用提供了理论支持,并且首次分离出具有固碳能力的糖丝菌属和游动放线菌属细菌。糖丝菌属和游动放线菌属同属于放线菌门,多存在于半干旱荒漠区,在45 ℃高温、5% NaCl浓度及UV-B辐射胁迫下仍保持>70%的存活率,具有抗旱、耐高温、耐辐射的特点,且均能产生萜类、酯类和糖苷类细胞代谢物39-40。此类次生代谢产物对灰霉病菌(Botrytis cinerea)和镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制率分别约为62.3%和58.7%,在防治虫害和植物病原真菌方面具有一定的应用价值41

根据分离结果可知,BSCs宏基因组测序结果中丰度较高的固碳菌红杆菌属(Solirubrobacter)未被分离,这可能与该菌属对微量有机碳(>0.1 mM葡萄糖当量)及Fe³+螯合因子(如铁载体浓度>50 μM)具有严格依赖性有关,而本研究的无碳源无机培养基提供的生存环境无法满足红杆菌属的基本生命需求42。在后期研究中,可通过改进培养基配方,使得更多的固碳菌株被分离。放线菌门的链霉菌属能够成为BSCs中优势固碳菌的原因如下:一是链霉菌对极端环境具有较强的耐受性,其产生的孢子能够抵抗不利的外界环境条件,分枝状菌丝体有利于土壤养分和水分迁移,同时能够降解纤维素和几丁质,增加土壤养分,有利于藻类的定殖和BSCs的演替43-44。二是链霉菌可产生抗生素和溶菌酶等多种细胞代谢物质,抑制其他微生物生长,增强自身竞争能力45。链霉菌的以上特性使其能够快速适应荒漠区干旱、能量供应胁迫的环境,导致其在沙地中能够维持较高的生存率和活性。

在固碳菌株分离培养方面,从毛乌素沙地裸沙中分离出的固碳菌株分别隶属于红球菌属、链霉菌属、节杆菌属、动球菌属(Planococcus)和微杆菌属(Microbacterium46。在黄土高原森林草原区分离出的固碳菌株包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、根瘤菌属(Rhizobium)和不动杆菌属,其中芽孢杆菌属隶属于厚壁菌门(Firmicutes)47。在荔波喀斯特洞穴,从沉积物中分离出的固碳菌株隶属于假单胞菌属、不动杆菌属、节杆菌属、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、剑菌属(Ensifer)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、拟节杆菌属(Paenarthrobacter)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、红球菌属、志贺氏菌属(Shigella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、贪噬菌属(Variovorax)和气单胞菌属(Aeromonas),其中黄杆菌属隶属于拟杆菌门(Bacteroidetes)48。造成分离菌株类群差异的原因可能是土壤微生物群落组成主要受土壤理化性质调控,在荒漠草原和农田中,可培养的微生物类群受pH值和土壤含水率影响49。此外,荒漠区养分贫瘠,固碳菌以寡营养类群为主,这些微生物类群能够在养分匮乏、能量较低的生境中生存;农田和湿地养分含量较高,固碳菌可能以富营养类群为主。因此,不同养分和能量对应不同固碳菌类群50-51

3.2 BSCs中化能自养型菌株固碳途径及其固碳能力评估

前期研究表明,毛乌素沙地裸沙地和BSCs中微生物固碳途径有6种:卡尔文循环途径(CBB)、还原性三羧酸循环途径(rTCA)、还原性乙酰辅酶A循环途径(WL)、3-羟基丙酸循环途径(3-HP)、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环途径(3-HP/4-HB)和二羧酸/4-羟基丁酸循环途径(DC/4-HB)。其中,rTCA途径的丰度最高,次之为CBB途径,其他固碳途径丰度较低3752。在干旱区,微生物固碳速率与编码CBB途径的关键酶基因丰度无显著相关性,而在稻田土壤中,两者具有显著的正相关,导致这种差异的原因可能是不同微生物类群的优势固碳途径存在差异53。rTCA固碳途径耗能较少,在养分限制的荒漠区占优势,CBB固碳途径耗能较高,在稻田、污泥和湿地等土壤中占优势5254-55。因此,只利用单一酶活性解析荒漠区微生物的固碳能力并不全面。基于上述内容,本研究分别利用CBB途径限速酶(RubisCO酶)和rTCA途径限速酶(ACLY酶)解析固碳菌株的固碳能力。发现ACLY酶活性相对较高的菌株共9株,分别为菌株1、5、6、7、9、10、12、16和17,意味着这些菌株可能以rTCA循环途径固碳为主;RubisCO酶活性相对较高的菌株共8株,分别为菌株3、4、8、11、12、15、16和18,意味着这些菌株可能以CBB循环途径固碳为主。因此,在后期应用时,可先将ACLY酶活性相对较高的固碳菌株施入裸沙地,待SOC积累一段时间后,再施入RubisCO酶活性相对较高的固碳菌株。除此之外,还发现同一菌株同时拥有两种较高的固碳酶活性,如菌株16,说明同一菌株存在通过多种途径进行固碳的可能。

菌液TOC含量的高低可指示菌株的固碳能力56。根据菌液TOC含量测定结果可知,菌株2、14虽有较低的RubisCO酶和ACLY酶活性却表现出较高的固碳能力,进一步验证了同一株菌可通过多种途径进行碳固定。多途径固碳的代谢机制允许菌株根据昼夜温差、水分或光照切换固碳策略,以适应荒漠极端多变的环境。例如,在极端干旱或氧气不足时,关闭CBB途径,依赖rTCA和3-HP途径维持基础代谢;在强紫外线照射时,rTCA途径产生的α-酮戊二酸可参与抗氧化;WL途径又可以使菌株在极端pH下固碳;在光照、水分和氧气条件充足时,通过CBB途径在白天固碳,夜间储存多糖57-59

综上所述,在前人研究的基础上与本实验结果相结合,分别选择了TOC含量较高的2、3、5、14菌株为固碳能力高的菌株。但这只是在培养基中理想环境的结果,沙地土壤环境更为复杂,下一步可将菌液施入沙地土壤进一步确认。

4 结论

从毛乌素沙地BSCs中筛选出18株具有稳定遗传特性的化能自养型菌株。其中,链霉菌属出现频率最高,表明该类群更加适应荒漠区环境,并在BSCs形成和发育阶段发挥着重要作用。同时,本研究首次验证了糖丝菌属和游动放线菌属细菌具有固碳功能,并且这2种菌在防治虫害和植物病原真菌方面也具有一定的应用价值,拓展了对荒漠区固碳微生物的认识。

18株固碳菌中,2、3、5、14菌株拥有较高的固碳和水解能力,表现出在荒漠区土壤改良中具有潜在的应用价值。其中,菌株5拥有较高的ACLY酶活性,可能更加适应荒漠区供能状况差的环境,后期可通过土壤控制实验加以验证。另外,菌株可通过多种途径进行固碳,只从固碳酶活性角度出发不能够很好地评价毛乌素沙地BSCs中化能自养型菌株的固碳能力。本研究加深了对荒漠区固碳微生物固碳机制的认识,更为荒漠区土壤改良提供了菌株资源。

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