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中国沙漠, 2020, 40(4): 128-137 doi: 10.7522/j.issn.1000-694X.2019.00121

毛乌素沙地锦鸡儿(Caragana)根系微域细菌群落多样性特征

周子渊,, 于明含,, 丁国栋, 高广磊, 何莹莹

北京林业大学 水土保持学院 水土保持国家林业局重点实验室/林业生态工程教育部工程研究中心/宁夏盐池毛乌素沙地生态系统国家定位观测研究站,北京 100083

Diversity of bacterial communities in the rhizocompartments of Caragana in the Mu Us Desert

Zhou Ziyuan,, Yu Minghan,, Ding Guodong, Gao Guanglei, He Yingying

Key Laboratory of State Forestry Administration on Soil and Water Conservation / MOE Engineering Research Center of Forestry Ecological Engineering / Yanchi Ecology Research Station of the Mu Us Desert, School of Soil and Water Conservation, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

通讯作者: 于明含(E-mail: ymh_2012tai@163.com

收稿日期: 2019-08-23   修回日期: 2019-12-24   网络出版日期: 2020-08-20

基金资助: 国家重点研发计划课题.  2016YFC0500905

Received: 2019-08-23   Revised: 2019-12-24   Online: 2020-08-20

作者简介 About authors

周子渊(1988—),男,甘肃会宁人,博士研究生,主要研究方向为荒漠化防治E-mail:zhou.zi.yuan@hotmail.com , E-mail:zhou.zi.yuan@hotmail.com

摘要

基于16S rRNA高通量基因测序技术,对毛乌素沙地小叶锦鸡儿(Caragana microphylla)、柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)根系微域(即根系、根际土、根区土、灌丛间空白土)间的细菌群落多样性和结构差异性进行表征。本研究对各根系微域间细菌群落的Alpha多样性指数进行了单因素方差分析以及基于OTU水平的PCA分析,探究其在根系微域间Alpha和Beta多样性的层级变化,证实了有关植物根系微域生态位分化的报道,并发现锦鸡儿属植物根系微域间细菌群落的多样性和结构组成随着4个微域类型由外及内呈现出显著的层级差异性(P<0.05)。通过对优势细菌群组的结构组成分析,发现锦鸡儿属植物对特定细菌群组具有显著的向根系内筛选富集的作用(P<0.05)。这种植物通过根系微域对特定细菌群组的逐级筛选富集作用,是导致锦鸡儿属植物灌丛下不同生态位间细菌群落结构和组成发生层级变异的主要原因。

关键词: 荒漠 ; 锦鸡儿(Caragana ; 土壤细菌 ; 多样性 ; 结构变异性

Abstract

Based on 16S rRNA high-throughput genome sequencing, the bacterial diversity and structural variability in the rhizocompartments (i.e.root, rhizosphere soil, root zone soil and inter-shrub bulk soil) of two Caragana spp.(Caragana microphylla and Caragana korshinskii) in the Mu Us Desert are studied.In this study, one-way ANOVA and PCA analysis based on OTU level with Euclidean distance were performed on the Alpha diversity indeices and Beta diversity of bacterial communities in each rhizocompartments, respectively.Then we confirmed the reports on the niche differentiation of plant rhizocompartments, the diversity and structural composition of the bacterial community in the rhizocompartments of desert leguminous plants showed significant differences, with a hierarchical transition of the four rhizocompartment types from outside to inside.We found that desert leguminous plants showed significant hierarchical filtration and enrichment of soil microbial communities under shrubs (P<0.05).The stratified selection and enrichment of specific bacterial groups by the rhizocompartments of plant is one of the main reasons for the hierarchical variation of bacterial community structure and composition in different ecological niches under the shrub of Caragana.

Keywords: desert ; Caragana ; soil bacteria ; diversity ; structural variability

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本文引用格式

周子渊, 于明含, 丁国栋, 高广磊, 何莹莹. 毛乌素沙地锦鸡儿(Caragana)根系微域细菌群落多样性特征. 中国沙漠[J], 2020, 40(4): 128-137 doi:10.7522/j.issn.1000-694X.2019.00121

Zhou Ziyuan, Yu Minghan, Ding Guodong, Gao Guanglei, He Yingying. Diversity of bacterial communities in the rhizocompartments of Caragana in the Mu Us Desert. Journal of Desert Research[J], 2020, 40(4): 128-137 doi:10.7522/j.issn.1000-694X.2019.00121

0 引言

荒漠地区气候条件极端恶劣,雨水稀少、土壤有机质和养分贫瘠、土地退化等都对区域生态系统稳定和生物多样性构成严重威胁[1]。通过生物措施改良改善土壤质地,提升土地肥力,进行生态植被恢复,是防治荒漠化、退化土地恢复最有效和可持续的手段[2]。广泛分布于中国荒漠沙地的锦鸡儿属(Caragana)植物根系萌蘖能力强、主根深入地下、抗逆性强,并有与土壤中的固氮菌结合共生固氮效能高的特点,在改善土壤肥力、固持土壤、防风固沙、植被恢复中有重要的作用,能够作为荒漠沙地生态恢复的先锋物种[3]

锦鸡儿属植物隶属于豆科、蝶形花亚科、山羊豆族、黄芪亚族,多为落叶灌木、半灌木,稀为小乔木。本属物种演化随着气候和地理类型的变化,具有一定的规律性。周道玮等[4]依据形态特征的差异性,认为该属植物总体沿着寒冷和干旱两个方向分布定植:一支演化为所有叶轴宿存、子房被毛的寒化特征;另一支则演化出所有叶片假掌状的旱化特征。这种植株形态性状特征的演化主要是气候和地理环境的胁迫下分化、适应的结果。本研究选取的锦鸡儿属为亚湿润半干旱地区的优势豆科植物。该属植物根系大多能够与土壤中广泛存在的根瘤菌结合形成具有固氮能力的根瘤,将土壤空气中的氮素固定为植物可以吸收利用的氨[3]

在生态环境整体恶劣的荒漠地区,植物群落的定植生长能够起到防风固沙的功效,尤以植物发达延伸生长的根系能够固持和改良土壤[5]。土壤作为植物生长的载体,不仅为植株生长提供养分支持,同时也在植物固定外来碳源的作用下,改良提升自身的理化和生物特性[6],而这其中土壤微生物发挥着重要的作用。荒漠植物群落的适应性很大程度上受土壤微生物的影响[7-8]。植物的生长与土壤微生物密切相关,土壤微生物群落代表了迄今为止世界上已知最大的生物多样性库[9]。根际是受根系分泌物影响的狭窄土壤微生态位,每克根可含有多达1011个微生物菌体[10]及3万多种原核生物[11]。越来越多的证据表明,这种根际微生物群落在决定相关植物健康和功能等方面具有重要作用,涉及植物根系内生菌群落及其遗传因素和多种环境因子综合的交互性作用[9-14]。如根际土壤微生物群落对植物抗病害方面的影响最为显著,大多数在土壤中传播的病原体需要在根际腐生生长才能够接触到宿主或在宿主周围达到足够数量,进而有效地感染宿主并脱离根际微域,而病原体能否成功感染宿主植物,受根际土壤微生物群落的显著影响[15]。还有研究指出,根际微生物群落对宿主植物的免疫系统具有调节作用[16]。而植物内生微生物是指寄生在植物组织内至少一段时间的细菌、古生菌、真菌或病毒群落,对寄主无任何不利影响[17]。它们在促进植物的生长发育、营养储备和抵御生物或非生物胁迫(如疾病、虫害、高温、盐或干旱)等方面起着关键作用[18-20]。豆科植物与根瘤菌的共生关系通过生物固氮和协同进化对于改善土壤质地和肥力具有巨大潜力[21]。Bulgarelli等[22]发现,一些植物内生菌是从根际土向植物根系内迁移而来的,并主要受到根际土壤因子的影响。

根际土中微生物群落的基因组比植物丰富,也被称为植物的第二基因组[9]。根际微生物在调节植物个体的健康、适应性和群落生产力等方面都发挥着难以替代的作用[9,23-26],而植物群落又通过影响土壤养分循环等生态过程影响土壤微生物群落[6]。此外,部分根际微生物可以进入植物根系组织形成植物内生菌群落,其群落结构组成与根际土壤微生物群落又有显著的差异性[27-28],这种细菌群落多样性和结构组成在根系组织内和根际土之间的显著差异现象被定义为“根际效应”[29]。Sun等[30]发现,毛乌素沙地旱生灌丛下和灌丛间的土壤细菌群落也出现在了细菌群落结构组成显著差异的现象。锦鸡儿属植物对荒漠环境的适应能力和生态恢复作用始终都受到高度的关注[5,31-32]。基于以上的研究结论,本研究的主旨设定为:①荒漠豆科锦鸡儿属灌丛下的4个根系微域(根系、根际土、根区土、灌丛间空白土)存在细菌群落多样性和结构组成的层级差异性变化;②探究荒漠豆科锦鸡儿属植物灌丛下根系微域细菌群落结构的层级变异性,及其发生变异的成因。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

该研究于2018年9月在位于毛乌素沙地南缘的宁夏盐池毛乌素沙地生态系统国家定位观测研究站(37°04′—38°10′N,106°30′—107°47′E)开展。研究站位于半旱区,属典型的大陆性季风气候,常年干燥温暖。年平均气温8.1 ℃,日间气温和相对湿度分别是-29.4~37.5 ℃和49%~55%。多年平均降雨量约为292 mm。降雨集中在7—9月,占年降雨量的60%~70%。当地的土壤类型主要为风成沙质土[31]。研究区0~1 m剖面土壤质地为砂质,平均容重1.5 g·cm-3。这一地区的生态退化主要是过度放牧、气候变化和风蚀造成的,干旱草原退化为目前的沙地。现在的植被恢复是在2001年通过飞播(油蒿、蒙古岩黄耆和细枝岩黄耆)、植苗扦插种植(小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿)和自然封育建立的[5]。目前该区的主要优势旱生灌木种包括油蒿、柠条锦鸡儿、小叶锦鸡儿、蒙古岩黄耆、细枝岩黄耆、沙柳等。

1.2 取样策略

小叶锦鸡儿(Caragana microphylla)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)在中国西北荒漠地区(包括该研究区内)都是自然共存并广泛分布的优势旱生灌木种。用于采样调查的锦鸡儿属植株均是在2001年通过植苗和扦插种植后自然封育形成的样地内采集的,两种锦鸡儿属植物造林初期植苗混交比例为1∶1。采样时,样地内植株平均株高为1.49 m,平均冠幅1.71 m×1.88 m,行距5 m。灌丛间偶见狗尾草、油蒿、蒺藜等植物。样本是在2018年6月的参试植物花期采集的。参试样本由豆科植物的4个根系微域构成:根系、根际土、根区土、灌丛间空白土。本研究涉及的样本植株主要分布在植苗后自然封育形成的固定沙丘上。选择5个样地(20 m×20 m,间距20 m),在固定的样地内随机选择3株豆科锦鸡儿属灌丛采集植株根系组织和土壤样本,分别将3个植株的样本按照4个根系微域类型划分,各自混合建立一个测试样本。参照Bulgarelli等[33]描述的方法采样。挖至植物根系,用镊子挖取围绕根系1 cm以内的土壤,作为根际土;之后挖出根系并轻轻摇晃植物根部,抖落附属的土壤,带无菌手套将落下的块土(根系1 cm以外的土壤)作为根区土收集在无菌样本袋中;灌丛间空白土则是在灌丛间的裸土下10~40 cm与根区土采样点同一深度采集;根系样本则来自植物根系的二级或三级分支,剪切采集粗细均匀健康无破损的根系5~8 cm于无菌样本袋中。

先将根系样本用大量无菌的双蒸水冲洗,然后将根系样本放在装有25 mL PBS缓冲液(PBS-S; 130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4, pH 7.0, 0.02% Silwet L-77)的50 mL离心管中震荡1 min,两个重复都换新的清洗液,两次间隔5 min;倒掉液体,将根放在新的装有25 mL PBS缓冲液的离心管中,超声波震荡30 s,两次重复间隔30 s;倒掉液体,收集清洗后根系样本。所有样本为20个DNA样本(豆科锦鸡儿属植物3个根系部位类型×5个重复+5个灌丛间空白土样)储存于-80 °C下用于分子生物学分析。

1.3 16S rRNA基因测序及生物信息学分析

依照说明书,使用E.Z.N.A.soil DNA kits (OMEGA,美国),从0.5 g的新鲜样本中提取DNA基因组并于-80 ℃下保存待用。将提取的DNA样本在冰上融化后分别离心并充分混匀,使用Nanodrop超微量分光光度计检测质量,取30 ng进行PCR扩增。使用上游引物F799(5′-AAC_MGG_ATT_AGA_TAC_CCK_G-3′)和下游引物R1193(5′-ACG_TCA_TCC_CCA_CCT_TCC-3′)扩增可变区为V5-V7区的16S rRNA,有研究显示对根系组织测序样本选择扩增可变区V5-V7区,能够有效减少宿主污染[34-36]。PCR扩增是在25 μL的反应缓冲液中进行,所述反应缓冲液含有12.5 μL KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix,1 μL Forward Primer(5 μM),1 μL Reverse Primer(5 μM),5 μL DNA(加入的DNA总量为30 ng),最后加入5.5 μL dd H2O补足至25 μL。PCR扩增的流程是:95 ℃下预变性5 min;95 ℃下变性45 s,55 ℃下退火50 s,72 ℃下延伸45 s,28个循环;72 ℃下延伸10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小,并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化。PCR产物用于构建微生物多样性测序文库,在北京奥维森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量测序平台进行Paired-end测序。

1.4 统计与分析

下机数据经过QIIME平台(Version 1.8,http://qiime.org/)根据Barcode序列拆分样本,使用Flash软件(Version 1.2.7)对数据进行过滤、拼接,去除打分低于20、碱基模糊、引物错配序列[35]。使用Usearch软件(Version 8.1.1861,http://www.drive5.com/usearch/)去除长度小于230 bp的序列,并根据Gold Database数据库用UCHIME方法[36]比对去除嵌合体序列。最后使用Usearch软件UPARSE算法[37](Version 1.1.579)对优质序列进行OTU聚类(Operational Taxonomic Units-分类操作单元),OTU相似性设置为97%。与Silva128数据库(Release128,http://www.arb-silva.de)使用RDP 分类器算法进行比对,得到每个OTU对应的物种分类信息。Alpha多样性指数的计算同样基于QIIME平台,分析时通常对数据进行抽平处理,以该数据中样本数据最少的数据量作计算,并采用97%的相似度进行分析。各指数的算法如下:

Chao1:即菌种丰富度指数,用以估计群落中的OTU数目。其公式如下:

Schao1=Sobs+n1(n1-1)2n2+1

式中:Schao1为估计的OTU数;Sobs为观测到的OTU数;n1为只有一条序列的OTU数目;n2为只有两条序列的OTU数目。

用Shannon指数估算样品中微生物多样性。

Hshannon=-i=1SobsniNlnniN

式中:Sobs为实际观测到的OTU数目;ni为含有i条序列OUT数目;N为所有的序列数。

观测深度Good’s Coverage公式为:

C=1-n1N

式中:ni为只有含一条序列的OTU数目;N为抽样中出现的总的序列数目。

采用单因素相似性分析,置换检验次数设置为999次,分析了基于Bray-Curtis距离的根系微域间OTU组成的差异性。ANOSIM是使用R的Vegan程序包(Version 3.3.1)实现的。为了比较各根系微域内已检测到的微生物群落组成,利用R软件的Vegan程序包对微生物群落的OTU数据进行了基于欧氏距离(Euclidean Distance)算法的主成分分析(PCA),统计显示各根系微域样本间细菌群落结构的总体相似性。为探究驱动微群落组成差异性的主要影响因子,我们使用描述群落组成关系和结构的算法计算各样本OTU水平数据的距离,即基于Bray-Curtis距离矩阵进行层次聚类分析。对所有筛选自4个根系微域的主要贡献优势门-目-属3个分类学水平的菌物相对丰度数据进行了对数转换,以满足数据后续分析的正态性和方差同质性;之后分别应用Shapiro-Wilk test和Levene检验了数据的正态分布和方差同质性。通过对Chao1、Shannon、Good’s Coverage等Alpha多样性指数的组间单因素方差分析,检验和评估在各根系微域间细菌群落的菌种丰富度、微生物多样性以及测序深度的层级差异性。以根系微域类型作为固定因子,建立模型为细菌群落Alpha多样性指数-根系微域的单因素方差分析(ANOVA),进行Tukey差异显著性检验,置信水平0.05,这些分析均使用SPSS20.0(SPSS Inc.,Chicago,美国)完成。

2 结果

2.1 根系微域细菌群落Alpha多样性

豆科锦鸡儿属植物所有样本的测序质量良好,4个根系微域样本共获得的下机序列个数分别为来自根系样本的423 396条,根际土样本的166 665条,根区土样本的334 509条,空白土样本的236 187条;质量控制后,保留的优质序列分别为来自根系样本的389 967条,根际土样本的132 835条,根区土样本的278 636条,空白土样本的195 430条。优质序列(clean reads)的长度分布集中于360~380 bp,占所有序列(reads)总数的86.49%。Good’s coverage指数对所有微域样本(根系、根际土、根区土、空白土)具有高度的可比性,值为95.13%~96.98%(表1),表明这样的测序深度足以可靠描述这些与植物根系微域相关的细菌微生物群落。

表1   根系微域细菌群落Alpha多样性指数及各分类学水平结构统计(n=5

Table 1  General features of the high-throughput sequencing results(n = 5)

Alpha多样性指数Chao1指数Shannon指数OTU数目Good’s Coverage指数
CM-r1 707.11±457.09b6.95 ± 0.64b1 024±276b96.98%±0.86%a
CM-rs2 790.39±319.51a9.44± 0.16a2 000±181a95.13%±0.74%b
CM-rz2 735.70±255.00a9.30± 0.28a1 915±186a95.24%±0.53%b
Bulk2 440.77±413.01a8.90± 0.41a1 728±278a95.76%±0.81%b

数据为平均值±标准差,n = 5;CM:锦鸡儿属植物,r:根系,rs:根际土,rz:根区土,Bulk:灌丛间空白土;不同的字母表征4个根系微域间存在显著的差异性(P<0.05)。

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基于Chao1指数、Shannon指数和OTU数目等,对根系微域间各样本的微生物Alpha多样性指数进行差异显著性分析(P<0.05)。数据显示,荒漠豆科锦鸡儿属植物根系样本与灌丛下土壤样本Alpha多样性存在明显的区别,灌丛下土壤样本多样性指数均显著高于植物根系样本,并都在根际土壤达到峰值(P<0.05,表1)。

2.2 根系微域细菌群落Beta多样性

基于OTU水平的PCA分析显示,根据不同荒漠豆科锦鸡儿属植物根系微域的类型(根系内、根际土、根区土、空白土),各根系微域样本类型下的细菌群落具有很强的聚类性(图1)。其PC1和PC2分别解释了总变异量的28.46%和18.68%,测试样本点按各自根系微域类型依照95%的相似性分别聚拢在一起,并由PCA图中的弧线分别区划。此外,层次聚类分析也显示4部分豆科植物根系样本按照各根系微域类型分别聚类。根际土和根区土、空白土分别与根系样本有明显的区别,但灌丛下各土壤样本并没有完全按照各自的根系微域类型聚拢在一起。ANOSIM分析结果显示,除根区土分别与根际土、空白土样本的组间差异不显著以外,其他各根系微域类型间均呈现出显著的差异性(P<0.05,表2)。ANOSIM相似性分析最终显示细菌群落结构随着根系微域类型(R=0.48, P=0.001)的不同而显著变化。

图1

图1   根系微域在OTU水平上驱动着细菌群落的组成

A:荒漠豆科锦鸡儿属植物根系微域细菌群落组成主成分PCA分析;B:基于Bray-Curtis差异性的样本层次聚类。CM:锦鸡儿属植物,r:根系,rs:根际土,rz:根区土,Bulk:灌丛间空白土。弧线所包含的样本,相似性水平在95%以上聚类

Fig.1   Rhizocompartment drives the composition of the bacterial communities at the OTU level


表2   4个根系微域样本ANOSIM分析

Table 2  ANOSIM analysis of rhizocompartments

根系微域RP
CMr-CMrs0.9120.005
CMr-CMrz0.9740.010
CMrs-CMrz0.1000.200
Bulk-CMr1.0000.008
Bulk-CMrs0.6400.005
Bulk-CMrz0.2280.100
r-rs-rz-Bulk0.4800.001

R>0,说明组间差异显著;R<0,说明组内差异大于组间差异。P<0.05 表示统计具有显著性。CM:锦鸡儿属植物,r:根系,rs:根际土,rz:根区土,Bulk:灌丛间空白土。

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2.3 各根系微域内的主要贡献细菌群组的结构和组成

豆科锦鸡儿属植物的4个根系微域细菌群落在门水平,主要由变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等10个主要贡献的优势菌门构成,这些菌门累计占到细菌群落总量的96%以上(图2)。其中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度灌丛间空白土<根区土<根际土<根系内;而放线菌门(Actinobacteria)正好与前者呈现出相反的趋势;Bacteroidetes则主要富集于根际土中。在目水平,根瘤菌目(Rhizobiales)、伯克霍尔德菌目(Burkholderiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)均为荒漠豆科锦鸡儿属植物根系内相对丰度占比较高的主要贡献菌目,灌丛间空白土<根区土<根际土<根系内。而在属水平,10个优势菌属由灌丛间空白土逐层向根系内的增加呈显著的分层富集趋势(P<0.05,图3);与之相反,10个相对丰度占比较高的优势菌属在4个根系微域间呈显著的分层递减趋势(P<0.05)。锦鸡儿属植物灌丛下根系内和根际土细菌群落门水平主要贡献菌门相对丰度占比最高的均是变形菌门(Proteobacteria),而在根区土和灌丛间空白土细菌群落的门水平主要贡献菌门相对丰度占比最高的为放线菌门(Actinobacteria)。根瘤菌目(Rhizobiales)是豆科锦鸡儿属植物灌丛下根系内、根际土、根区土中细菌群落相对丰度占比最高的优势菌目,而灌丛间空白土中细菌群落相对丰度占比最高的优势菌目为Gaiellales。

图2

图2   豆科锦鸡儿属植物4个微域微生物群落门-目水平物种组成

CM:锦鸡儿属植物,r:根系,rs:根际土,rz:根区土,Bulk:灌丛间空白土;前10以外的门、前20以外的目记为others

Fig.2   Microbial community compositions in the four rhizocompartments of Caragana Fabr. at the phylum and order levels


图3

图3   豆科锦鸡儿属植物灌丛下,与根区土壤相比其他3个根系微域OTU相对丰度显著富集(A)和减少(B)的韦恩图,C显示相对富集的OTUs对应的菌属;D显示相对减少的OTUs对应的菌属

CM:锦鸡儿属植物,r:根系,rs:根际土,rz:根区土,Bulk:灌丛间空白土

Fig.3   Venn diagrams showing significant enrichment (A) and reduction (B) of the relative operational taxonomic unit (OTU) abundances in the three rhizocompartments compared to root zone soil. C, the bacteria genera corresponding to relatively enriched OTUs; D, the bacteria genera corresponding to relatively reduced OTUs


荒漠豆科锦鸡儿属植物根系内生菌群落在目水平的主要贡献优势菌目分别是根瘤菌目(Rhizobiales,35.04%)、黄单胞菌目(Xanthomonadales,5.74%)、伯克霍尔德菌目(Burkholderiales,5.56%)等构成(图2)。这些展示的菌目各自相对丰度占比均大于3%,累计占根系内生菌群落结构和组成在目水平总量的66%以上。根系内相对丰度占35.04%的根瘤菌目(Rhizobiales)其下属水平主要由慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)等构成,这些菌属在4个根系微域间均呈现出显著的灌丛间空白土<根区土<根际土<根系内的分层富集趋势(P<0.05)。

2.4 根系微域间特定细菌群组的筛选与富集作用

由于根系微域内的细菌群落都源于灌丛下的土壤中,而以上的研究结果显示各根系微域间的细菌群落结构组成还是存在着显著的差异性。为了调查引起灌丛下根系内、根际土、根区土分别与灌丛间空白土细菌群落结构组成差异性的菌物类型和缘由,以灌丛下空白土OTU序列为对照,应用Metastats(mothur v.1.34.4https://www.mothur.org)对各根系微域组间进行差异显著性分析,计算中选取P<0.05的OTUs进行组间对比分析。最终得到灌丛下根系内、根际土、根区土分别与灌丛间空白土细菌群落相对显著富集和显著减少的OTU。由图3可知,根系内、根际土、根区土的细菌群落相较于灌丛下空白土显著富集的OTU个数分别有109、311、205个,显著减少的OTU个数分别有632、295、166个。这些在4个根系微域间表现出相对富集效应的OTU分别在菌物分类学属水平对应着的10个相对丰度较高的优势菌属,这些优势菌属均表现出显著的向根系富集的趋势(P<0.05)。

根系内细菌群落相对减少的632个OTU,分别有277、162个与来自根际土和根区土的OTU表现出一致的减少效应;而根际土中相对减少的295个OTU,其中有122个OTU与来自根区土的表现出一致的减少效应;而根区土中细菌群落相对灌丛间空白土显著减少的OTU个数相对较少,根系内相对显著减少的OTU个数最多(P<0.05)。同样我们统计分析了这些在4个根系微域间表现出相对减少效应的OTU分别在菌物分类学属水平对应着的10个相对丰度较高的优势菌属,这些优势菌属均表现出显著的向根系减少的趋势(P<0.05)。

3 讨论

3.1 根系微域细菌群落组成

本研究采用16S高通量测序技术,分析了荒漠豆科锦鸡儿属植物根系微域中细菌群落在菌物分类学门、目、属水平上的结构和组成,探究了豆科锦鸡儿属植物根系内、根际土、根区土、灌丛间空白土与优势OTUs对应相关的主要贡献细菌群组在门、目、属3个分类学水平上的结构和组成。这极大地扩充了我们对于荒漠豆科锦鸡儿属植物根系微域细菌微生物多样性的认识。这比前人基于特定菌株分离培育鉴定的方法更加全面和精准[38-39]。这表明,荒漠豆科锦鸡儿属植物根系内生菌群落结构组成远比我们之前分离培养鉴定的要复杂和多样化。

本研究检测到在各根系微域中细菌群落的主要贡献细菌群组,在门水平分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等(图2)。相关研究指出,变形菌门(Proteobacteria)向灌丛下土壤富集的程度与土壤有效碳含量呈正相关,并且其在有效碳含量高的区位与所处生态位异养固氮能效密切相关,即它具有促进土壤中铵态氮被转化利用的作用[40];放线菌门(Actinobacteria)最突出的特性之一是能够产生大量的、种类繁多的抗生素、酶和生长调节剂,在抑制植物疾病、土壤病原体传播等方面发挥着重要作用[41-42],并且其向根系的富集趋势与土壤pH呈正相关[41];绿弯菌门(Chloroflexi)则通过利用硫化物作为电子供体进行光合作用能够导致土壤CO2的减少[43];而灌丛下拟杆菌门(Bacteroidetes)的富集是由于它们能够迅速地利用土壤有机质[44]

综上所述,这种与寄主植物相关的优势菌群在各根系微域逐级向根系富集的趋势或许并不只是由寄主植物对有益细菌的筛选作用所主导的,还可能是由某些细菌对适宜生态位的投机性迁移、定殖引起的[12]

3.2 根系微域细菌群落结构的变异性

荒漠豆科锦鸡儿属植物4个根系微域的样本间Alpha和Beta多样性都存在显著的差异性(P<0.05)。荒漠豆科锦鸡儿属植物通过根系微域对灌丛下土壤细菌群落中特定的优势菌群具有筛选富集作用。Beckers等[12]在毛白杨的根系内和根际土生态位的研究中也得到了类似的根系微细域菌群落结构差异性结果,并认为这可能是由于灌丛下的细菌群落是随着根系分布而迁移定殖不均匀造成的。我们的数据表明,植株对根系内定殖的大量内生菌中特定的细菌微生物群组的筛选富集作用是根系内生菌群落发生高度变异性的主要原因。现有的研究表明,向植物根系对特定细菌群组的筛选富集主要通过以下两种途径:①根系分泌物,尤其是植物根际部位分泌含碳代谢产物[45-46];②植物通过化感作用释放化感物质,对土壤细菌微生物产生的化学诱导作用[47]。虽然根系分泌物等衍生的营养物质和趋化诱导在根际微域这个生态位广泛存在,但与植物相关的特定有益细菌则需要通过激烈的养分竞争才能成功地迁移并定殖于根系内[48]。综上所述,内生菌迁移并定殖于根系内形成一个结构组成相对稳定的群落似乎经历了一个高度变异的过程,这从我们的Alpha多样性(表2)、主成分分析(图1)、根系微域间优势菌群筛选富集分析(图3)、ANOSIM细菌群落结构相似性分析(表3)中都可以得出这样的结果。

我们检测到荒漠豆科锦鸡儿属植物灌丛下根系微域间细菌群落中被逐层筛选富集的根瘤菌属(Rhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)是预期之中的,因为这是已知的能够与豆科植物共生固氮的根瘤菌[49-50]。有研究指出,传统认知上豆科植物与根瘤菌的共生关系是具有“宿主专一性”的,即特定的豆科植物只与特定的根瘤菌结瘤固氮。近年来分子生物学基因测序技术表明根瘤菌与豆科植物的共生关系并非传统认知的“宿主专一性”,而是由其共生基因所决定的,根瘤菌凭借共生基因的多样性实际拥有大量的宿主植物,这又被称为“广谱共生”现象[50-51]。陈文新[50]提出在应用豆科植物进行植被生态环境恢复时,应考虑到根瘤菌共生基因多样性特点,针对不同的生境和宿主植物制备和选择接种抗逆性强、广谱效益高的根瘤菌菌剂。在被植物筛选富集的其他特定菌属中,贪噬菌属(Variovorax)作为一种植物促生菌既可以促进农作物的生长又可以快速降解土壤中的污染物丙烯酰胺,可以作为一种生物降解剂应用于被丙烯酰胺污染的农田中,对于环境修复具有重要价值[52]。鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)是一类丰富的新型微生物资源,可用于芳香化合物的生物降解。该属菌株凭借自身的高代谢能力与多功能的生理特性,在环境保护及工业生产方面具有巨大的应用潜力[53]

此外,我们发现在根系微域间还存在大量相对丰度差异性变化的菌物,其绝大多数都被植物根系筛选富集,并且这种寄主植物内生菌群落组成,优势菌属在根系微域间大量重叠的现象说明(图3),内生能力(有效的筛选、富集、定殖)和植物根系微域(营养有效性/变异性、生境适宜性等)都是为前述涉及的特定优势菌群保留的[12]

4 结论

本研究揭示了荒漠豆科锦鸡儿属植物各根系微域细菌群落的多样性现状,并探究了各根系微域间细菌群落结构组成的层级变异性。我们发现荒漠豆科锦鸡儿属植物通过根系微域对土壤中特定的优势菌群具有显著的逐级筛选富集作用。这种寄主植物对特定细菌群组的筛选作用以及某些细菌对适宜生境的投机性迁移定殖,最终导致了根系微域间细菌群落结构和组成的层级变异性。此外,我们的数据也证实了荒漠豆科锦鸡儿属植物灌丛下根系微域的存在,每一个根系微域都能够代表一个独立的生态位,并且各生态位之间都因植物、土壤、微生物的交互作用而密切相关。再结合豆科锦鸡儿属植物在荒漠生态环境中的优良适应性,这就为荒漠生态植被恢复提供了一个基于荒漠旱生植物与土壤微生物交互性作用研究的理论基础和数据支持。

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