葡萄是世界广泛栽培的果树，为落叶藤本植物。中国是葡萄生产大国，葡萄产量约占全球葡萄产量的20%^［1］，2007—2016年中国葡萄产量快速增长，成为国内第四大水果，2018年，中国的葡萄栽培面积已超过70万hm²，产量也已超过1 300万t，是改革开放初期的78倍。目前，中国葡萄栽培面积世界排名第二，产量居世界首位^［2-4］。

芳香物质是水果的标志性特征，是构成葡萄品质的主要指标。葡萄果实香味由多种化合物组成，主要有萜烯类、C13-降异戊二烯衍生类、芳香族化合物、挥发性脂肪族化合物、吡嗪类化合物和含硫化合物^［5］。不同葡萄品种呈现出不同的香味，葡萄的成熟度、土壤条件、光照强度等环境因素与栽培管理技术也会影响芳香物质的形成^［6］。气候变化对酿酒葡萄果实芳香物质积累的影响明显大于葡萄园的海拔，随着葡萄园海拔的增加，酿酒葡萄果实中吡嗪类和直链脂肪醛类物质的含量显著升高，因此应适当延迟采收以减少果实的生青味^［7］。魏志峰等^［8］对葡萄果穗进行套袋处理后，果袋内外光照强度、温度、湿度和透光率产生差异，能够显著影响果实的外观品质与芳香化合物的种类。魏玲玲等^［9］对‘阳光玫瑰’葡萄果实在盛花期后1周进行单穗不同留果量处理，结果表明每穗保留40个果粒能够明显改善果实的外观品质，并且有利于葡萄果实后期芳香物质的积累。史祥宾等^［10］以‘京蜜’葡萄为试验材料，提出高光效省力化“V”形叶幕设施栽培葡萄的果实香气更浓，更能体现品种特性。史星雲等^［11］指出，施肥处理能够显著提高葡萄果实芳香物质的含量、改变果实中芳香物质种类，提高酿酒葡萄品质。可见，环境调控能够有效刺激葡萄果实中挥发性成分的合成，进而影响果实的风味与感官品质。

前人研究主要在氮肥种类及施入总量对果实芳香物质形成的影响方面，不同施氮时期如何影响芳香物质的形成还未见报道。本研究以‘马瑟兰’为供试材料，在不同生长发育时期一次性施入氮素，对采收期葡萄果实芳香物质成分及含量进行测定，分析施氮时期对成熟期果实中芳香物质种类和含量的影响，以期对氮素调控酿酒葡萄芳香物质合成，进而为酿造高品质葡萄酒提供理论依据。

试验于2016—2019年在甘肃省武威市林业科学研究院进行，该试验基地海拔1 632 m，日照充足且昼夜温差大、土层深厚、透气良好，年降雨量为191 mm，年平均气温6.9 ℃，气候凉爽，无霜期150 d，试验地原料土壤为中性到弱碱性的砾质沙壤土。以‘马瑟兰’葡萄作为供试品种，树龄为9年生，株行距为0.5 m×3 m，无主蔓扇形整形，每株选留5个结果枝，结果枝各留1穗果。试验地采用滴灌方式进行灌水，年灌水量为4 800 m³·hm^-2。P₂O₅和K₂O的施入量分别为120 kg·hm^-2和240 kg·hm^-2，分别在萌芽前施入总施肥量的40%、新梢生长旺期施入20%、果实膨大期施入30%、果实转色前施入10%，施入时，在距离葡萄主干30 cm开沟，均匀施入后灌水。

共设置6个施氮时期，分别为S1（萌芽期）、S2（新梢旺长期）、S3（开花期）、S4（果实第1次膨大期）、S5（副梢旺长期）和S6（果实第2次膨大期），分别在对应生育期一次性施入尿素300 kg·hm^-2，其他时期均不再施入氮肥，以不施入氮肥作为空白对照（CK）。单行作为一个处理，每行定值120株，每个处理设置3次生物学重复，共21行，连续3年施肥处理并在第3年（2019年）采样，分析不同处理芳香物质特征。在果实成熟期选取大小一致、着色均匀、无病虫害、无机械损伤的果穗，每行取10个果穗作为一个重复，每个处理共取30个果穗，采样后立即带回实验室。从每个果穗的上、中、下3个部位随机选取30粒果实，液氮速冻后-80 ℃下保存待测。

1310-ISQ型气相色谱-质谱联用仪（Thermo Scientific，美国）；75 μm CAR/PDMS手动SPME进样手柄、萃取头（上海安谱科学仪器有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器厂）。

果实芳香物质的测定参照Wang等^［12］的方法并加以改进。从超低温冰箱内取出葡萄样品，去除果梗、葡萄籽，称取100 g放入小型榨汁机打成匀浆，加入1 g PVPP和0.5 g D-葡萄糖酸内酯，4 ℃下超声提取30 min，8 000 r·min^-1离心10 min，取上清液备用。吸取10 mL上清液转入20 mL进样瓶中，加入2.4 g氯化钠和50 μL 浓度为88.2 ppm 的2-辛醇（内标物），并放入磁力搅拌转子，用硅胶隔垫加盖密封。用DVB/CAR/PAMS纤维萃取头于40 ℃下萃取30 min，后用GC-MS进样分析，每个处理设置3次生物学重复。

进样量1 μL，不分流进样。进样口温度为240 ℃；程序升温为：初始温度40 ℃下保持2 min，以3 ℃·min^-1升至210 ℃后，再以5 ℃·min^-1升至240 ℃并保持5 min。电离方式EI；电离电压为70 eV，在35—350 m·z^-1的质量范围内进行扫描。最后将检测出的化合物通过NIST和Wiley质谱库检索比对鉴别^［13］。

根据前人已有的研究报道得出各挥发性物质的气味描述及阈值^［14-18］（化合物气味阈值均为在水中的阈值浓度），分析果实芳香物质特征；参考Wu等^［14］的方法将葡萄果实的芳香物质分为7个芳香系列（图2）。

采用Excel 2010软件对试验数据进行统计处理，采用SPSS 20软件进行单因素方差分析来对比其差异显著性，利用Origin 2018软件构建葡萄果实香气轮廓图。

如表1所列，共检测出8大类40种芳香物质成分，分别为10种醇、9种醛、3种酯、3种酮、5种酚、3种酸、6种烷烃类和1种烯烃类。各处理之间芳香物质组分与含量均存在显著性差异，S2、S3、S4、S5和S6处理后芳香物质种类与对照相比显著增加，其中S3处理后芳香物质种类最多，有28种，S1处理后芳香物质种类与对照相比显著减少，为21种；7个处理下芳香物质总量1 789.49—7 719.33 μg·kg^-1，其中对照芳香物质总含量显著高于其他处理，达7 719.33 μg·kg^-1，其余处理下芳香物质总含量从大到小依次是S6、S5、S2、S1、S4、S3，其对应含量分别为7 719.33、3 320.29、2 728.87、2 250.64、2 171.74、2 167.70、1 789.49 μg·kg^-1。从图1可知，每个处理下醛类、醇类和烷烃类含量较高，其累计含量占总含量的92%以上，而酯类、酮类、酚类、酸类和烯烃类含量均较低，其含量与总含量的比值为0.05%—4.97%。

醛类和醇类是‘马瑟兰’葡萄果实中重要的芳香物质，且这2类化合物在果实芳香物质总含量中所占比重较大，醛类占芳香物质总含量的62.15%—81.07%，醇类占芳香物质总含量的11.30%—33.01%。施氮处理后共检测到醛及醇类物质共9种，分别为苯甲醛、苯乙醛、反式-2-己烯醛、己醛、1-壬醇、苯乙醇、反式-2-己烯-1-醇、香叶醇和正己醇。S5处理后果实中苯甲醛含量显著高于其他处理，为391.59 μg·kg^-1，S5、S6处理后果实中苯乙醛含量与其他处理相比显著提高，其中S2处理后该化合物含量最低，为5.30 μg·kg^-1，约为S5处理的10.75%；反式-2-己烯醛和己醛的含量在对照处理下均显著高于其余处理，且在对照处理下这两种化合物含量均显著高于其他种类化合物，含量分别为3 440.98 μg·kg^-1和2 224.15 μg·kg^-1，累计含量占该处理中芳香物质总量的73.34%。果实中苯乙醇和香叶醇两种芳香物质成分均属于花香味香气类型，二者含量在S1和S3处理后均显著低于对照处理，每种化合物含量平均降低了40 μg·kg^-1。从醛类和醇类化合物组分可以看出，2-庚醇和1-十六烷醇是S6处理独有的芳香物质组分，含量分别为5.50 μg·kg^-1和5.96 μg·kg^-1；（E，E）-2，4-己二烯醛、3-己烯醛和反式-2-辛烯-1-醇是CK独有的芳香物质组分，含量分别为5.03、82.38 μg·kg^-1和2.02 μg·kg^-1；癸醛具有特殊的油脂气味，是S4处理独有的芳香物质组分，含量为1.29 μg·kg^-1。

烷烃类、酮类和酚类物质在不同施氮时期处理下均能检测到，但3类化合物含量存在显著差异。不同处理下烷烃类物质含量80.14—189.65 μg·kg^-1，其中共有成分为十二烷、正十三烷和十六烷，十七烷是S3处理独有的芳香物质组分，含量为2.82 μg·kg^-1。共检测到3种酮类化合物，分别为β-紫罗酮、甲基庚烯酮和香叶基丙酮。随着施氮时期的推迟，果实中酮类物质总含量呈现出先升高后降低的趋势，在S2处理时达到最大值，为36.63 μg·kg^-1，在S3处理时酮类物质含量略有下降，但该类物质的相对含量达到最大值（1.80%）；β-紫罗酮在各处理后均能检测到，但是含量存在显著差异，在S1、S2、S3、S4和S5处理下β-紫罗酮含量显著低于S6和对照处理；香叶基丙酮和甲基庚烯酮在施氮处理后均能检测到且含量无显著性差异，但在对照中未检测出。2，4-二叔丁基苯酚、苯酚和邻甲酚在各处理后均能检测到，且随着施氮时期的推迟，2，4-二叔丁基苯酚含量呈现出波动性变化；2，6-二叔丁基对甲酚含量在对照处理时最大，为133.2 μg·kg^-1，随着施氮时期的推迟总体上表现出下降趋势，且在S1处理后迅速下降，在S4—S6处理后未检测到，间甲酚是S6处理独有的芳香物质组分。十四酸乙酯和棕榈酸异丙酯分别出现在S2、S3和S2、S3、S4、S5处理果实中，且含量无显著性差异；乙酸仲丁酯为S5处理的独有芳香物质组分。乙酸出现在S3和S5处理后，且后者含量显著高于前者；己酸和反式-2-己烯酸是S4处理的独有芳香物质组分。

不同处理‘马瑟兰’果实中共检测出40种芳香物质，各类芳香物质含量存在差异，香叶醇、苯乙醛、反式-2-己烯醛、己醛和β-紫罗酮为各处理共有特征芳香物质成分，构成草香、花香和脂膏香为主体的香味特征。

由表2可知，本研究中共鉴定出11种特征芳香物质，包括3种醇、7种醛和1种酮，醇和醛类物质是草本香、花香味的主要贡献者，其中苯甲醛散发的芳香和焦糖味又能增强葡萄果实中的甜味和烤香味。醇类化合物有反式-2-己烯-1-醇、香叶醇和正己醇，该类物质的香气值均在S6处理后达到最大值，但与对照相比无显著性差异，香叶醇的香气值在各处理中均大于1，而正己醇含量只有在对照和S6处理后大于其阈值，对葡萄果实香气产生作用。苯乙醛、反式-2-己烯醛和己醛的香气值在各处理后均大于1，但香气值存在显著性差异，说明这3种醛类化合物对不同施氮时期处理后的葡萄果实香气贡献有所不同，其中己醛贡献最大、其次为反式-2-己烯醛，苯乙醛的贡献最小。CK、S4和S5处理与其他处理相比表现出一定的特异性，S5处理后果实中苯甲醛的香气值大于1，而其他处理苯甲醛的香气值均小于1；S4处理后果实中癸醛的香气值以及对照中3-己烯醛的香气值均大于1，而其他处理未检测到这两种物质。在所有处理中均检测到β-紫罗酮且香气值均大于1，说明此化合物是‘马瑟兰’葡萄的特征成分且不受施氮时期的调控。

为进一步有效了解不同施氮时期‘马瑟兰’葡萄果实芳香物质组分总体分布状况，使用香气值和葡萄酒香气轮盘建立‘马瑟兰’葡萄的香气轮廓图。在检测出的芳香物质中香叶醇、苯乙醛、反式-2-己烯醛、己醛和β-紫罗酮为共有特征芳香物质成分，构成草香、花香和脂膏香为主体的香味特征（图2）。‘马瑟兰’葡萄的香型以草香为主，其次为花香、脂膏香，不同施氮时期处理后以花香、草香、脂膏香和果香为主，但浓郁程度各不相同。S1处理后果实中草香最为浓郁，其次为花香和脂膏香，但与对照相比果香味有所增加；S2处理后果实中花香与脂膏香同时减少，而草香和果香与S1相比无显著变化；S3处理后果实中以花香和脂膏香为主，其次为草香，果香型香气值与前者处理相比显著增加；S4处理后花香型与脂膏香型的香气值显著降低，果实香味以草香为主，其次为花香、脂膏香和果香；S5处理后果实中各香型的分布情况与S4相同，但各香味类型的香气值均有所增加；S6处理改变了果实香味分布情况，其中花香型和脂膏香型的香气值与其他施氮时期相比显著增加，且在该处理下二者香味最为浓郁，其次为草香，但无果香味。

葡萄酒中芳香物质超过1 300种，主要包括醇类、醛类、酮类、酸类等，其中芳香物质的来源既受到葡萄果实本身的影响，也受到葡萄酒发酵处理过程及陈酿方式的影响，而葡萄品种本身的影响决定了葡萄酒的口感结构及风味^［19-20］。本研究发现，‘马瑟兰’葡萄果实中芳香物质成分在6个不同施氮时期处理下均以醇类和醛类化合物为主，占芳香物质总量的83.81%—95.54%，而酯类化合物含量较低；果实第二次膨大期施氮肥‘马瑟兰’果实中芳香物质总量及香气值显著高于其他施氮时期，为3 320.29 μg·kg^-1，其中开花期施氮处理果实中芳香物质总量最低，为1 789.49 μg·kg^-1，但芳香物质种类最多。

Encarna等^［21］发现在葡萄成熟期芳香物质变化过程中C₆化合物含量很高且对葡萄芳香物质成分贡献较大，因此该类化合物可作为判断葡萄果实最佳成熟期的重要指标。本研究中醇类、醛类物质含量最高，其中C₆醇和C₆醛类化合物总量是其他醇类、醛类物质总含量的3—15倍，且随着施氮时期的推迟此类化合物含量呈现出先降低后升高的趋势，在开花期施氮时含量最低，为1 188.84 μg·kg^-1。C₆化合物含量较高在樱桃^［22-23］、海棠^［24］、木瓜^［25］、杏^［26］等不同果实中都有研究报道，Wu等^［14］认为C₆化合物是所有葡萄品种的基础芳香物质，本研究中C₆化合物总量占芳香物质含量的66.43%—88.81%，这与前人研究结果一致，康文怀等^［27］对不同品种酿酒葡萄浆果中C₆醛、醇类化合物含量进行对比分析，发现‘赤霞珠’、‘梅鹿辄’和‘品丽珠’果实中C₆醛、醇类化合物的相对含量均大于80%。本试验在‘马瑟兰’葡萄果实中检测出的C₆醇和C₆醛类化合物分别为反式-2-己烯-1-醇、叶醇、正己醇、反式-2-己烯醛、己醛和（E，E）-2，4-己二烯醛，其中反式-2-己烯醛含量在不同施氮时期处理及对照中均显著高于其他芳香物质，且该芳香物质组分表现出青草、草木气味，由于其阈值较低而含量较高，因此对果实的草香味贡献较大，这与前人研究结果一致^［27-30］。

张劲等^［29］利用OAV法分析‘桂葡3号’葡萄果实中的芳香物质，结果表明检测到39种芳香物质成分，其中有7种成分的OAV值较高，可视为该品种的特征芳香物质成分，分别为丁酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、异丁酸乙酯、己酸乙酯、己醛、4-羟基-2-丁酮和戊酸乙酯，这与本试验结果存在差异，可能是品种不同造成的差异。本研究中不同施氮时期处理后有11种特征芳香物质成分，其中有5种共有特征芳香物质成分，分别为香叶醇、苯己醛、反式-2-己烯醛、己醛和β-紫罗酮，且β-紫罗酮和己醛的香气值最高，这两种化合物分别呈现出脂膏香、玫瑰香、紫罗兰香和青草、草木、绿色蔬菜气味，这与史星雲等^［11］的研究结果一致。张文文等^［30］检测3种巨峰系葡萄的芳香物质含量，发现己醛、3-己烯醛、（E）-2-己烯醛、壬醛、癸醛、β-大马酮和β-紫罗兰酮的气味活性值均较高，且不同葡萄品种的特征芳香物质成分有所差异，各自的特征芳香物质成分与共有特征芳香物质成分共同决定其香气特征。山东不同产区‘巨峰’葡萄（E）-2-己烯醇、2-己烯醛、乙酸乙酯、酞酸二乙酯、香叶基丙酮和二苯并呋喃为特征芳香物质成分，且适当增加施肥量能够显著提高芳香物质总量和脂肪族类物质含量，产区因素是影响该葡萄品种芳香物质组分与含量的主要原因^［30］。本研究中共同特征芳香物质成分组成了‘马瑟兰’葡萄果实的基础芳香物质，不同施氮时期处理后果实中各自的独有特征芳香物质成分形成了处理间的特异性。施氮不同改变了‘马瑟兰’果实以草香为主的香味特征，施氮时期后延果实草香味所占比重逐渐减小，花香和脂膏香比重逐渐增大，开花期施氮果实草香、花香和脂膏香味基本平衡，同时在该时期施氮后，果实中果香味逐渐增加，果实第1次膨大期施氮肥果实果香味占比达到最大，果实第二次膨大期施氮处理后果实无果香味，而脂膏香和花香味占比最大，草香味占比明显减小。可见，氮肥施用时期可改变‘马瑟兰’果实以草香味为主的香味特征，在果实品质改善研究中具有重要意义。